在小鼠早期神经母细胞谱系中重建耳泡结构

在单细胞精度上重建小鼠耳泡以及早期的神经母细胞谱系 SUMMARY 耳泡（otocyst）含有成熟内耳中绝大部分细胞类型的祖细胞。发育谱系分析以及基因 表达研究提示在早期耳泡中，不同的祖细胞群被分隔在分散的轴向区域中（axial domains） 。 本文中，我们对 382 个取自发育中耳泡及神经母细胞谱系的细胞个体做了高并行定量 RT- PCR（highly parallel） ，评估其中的 96 个基因，这些基因代表着确定的耳标志物，信号 -通 路相关转录产物，以及新的耳特异性基因。通过对数据矩阵进行多元集簇分析，主要成分 分析，以及网络分析（multivariate cluster, principal component, and network analyses） ，我 们得以确定神经母细胞的不同分层，并在单细胞精度上描述了这个细胞群中基因表达的渐 进性过程。这进一步耳泡的一个三维模型，在这个模型中，每个细胞个体都可以在空间表 达域上精确地定位。我们的生物信息模型显示了在早期神经母细胞发育及感觉前体区域 （prosensory domain）特化过程中不同信号通路活化的空间动态。 INTRODUCTION 在本研究中，我们使用耳泡，也就是脊椎动物内耳的前体来充当模型系统，以探索 96 个基因在空间上，时间上，以及功能水平上的单细胞转录特征。耳泡是一个三维结构，源 自听板（otic placode） ，与发育中的菱脑相邻（Fritzsch et al.,2002; Morsli et al.,1998） 。它含 有会产生内耳，以及前庭与耳蜗神经元的细胞群中的绝大部分（Corwin and Cotanche, 1989; Groves and Fekete, 2012; Swanson et al.,1990） 。 尽管人们通过对单个基因表达方式的研究累积了丰富的知识（Alsina et al.,2009; Radde- Gallwitz et al.,2004） ，但尚不清楚位于耳泡中不同位置，比如说背部或腹部的特定类型的细 胞群性质是否一样，或者是否可以进一步细分成更小的，由空间位置决定的细胞亚群。同 样的，人们猜想源自耳泡的发育中感觉器官及神经母细胞，是不同细胞或细胞群，周围组 织影响，以及细胞命运限定之间区域性协同关系的产物（Brigande et al.,2000; Fekete and Wu, 2002; Groves and Fekete, 2012; Wu and Kelley, 2012） 。 基于细胞群的研究手段无法识别出少见的细胞类型，也无法显示那些用活化信号通路 来决定细胞身份的基因的空间关系。与之相比，单细胞分析技术是一种强有力的工具，可 以研究全局性细胞异质性，以及在局部水平上描述机制（Tischler and Surani, 2013） 。我们 的目标是用小鼠耳泡作为一个简单却高度组织性细胞系统的范例，并用单细胞定量基因表 达分析来获得对区域性细胞身份，动态过程，以及活化信号通路区域的了解。我们用微阵 列做了 36672 份个体定量 RT-PCR，分析了 382 个小鼠耳泡细胞和神经母细胞个体。利用相 互关系，主要成分，以及网络拓扑结构的三重互补分析（three complementary analyses） ， 我们识别出了细胞特异性转录模体中遗传下来的神经母细胞发育过程的动态结构。我们在 已知的空间性基因表达类型的背景下，进一步应用生物信息学方法，通过计算建立了一个 耳泡器官模型，在单细胞水平上提供了深入的生物学视野。我们的分析描述了耳部发育过 程中的时间和空间成分。这使得我们可以将高维度数据整合成简单的模型，使我们对细胞 异质性有更好的理解。 RESULTS 耳泡细胞和神经母细胞个体的转录分布情况 在哺乳动物内耳发育期间，转录因子 Pax2 是第一种在听板中被发现的因子，并且在发 育过程中持续在耳泡中表达（Hidalgo-Sanchez et al.,2000） 。在 Pax2Cre+/-；Gt(ROSA) 26SormtdTomato,mEGFP 报导小鼠中（ Muzumdar et al.,2007; Ohyama and Groves, 2004） ，听板的后 续发育产物包括所有的耳泡细胞，以及分层的，表达 membrane-EGFP 的神经母细胞，而周 围的非耳部细胞继续表达 memberane-tdTomato 荧光蛋白（ Fig.1A and 1A） 。利用荧光活化 细胞分类技术（FACS） ，我们在胚胎第 10.5（E10.5 ）时从耳泡及其紧密相邻组织中收集了 384 个 membraneEGFP(+)/memberane-tdTomato(-)细胞（Fig.1B and Fig.S1 online） 。我们用微 流体定量 PCR 平台定量测定了 96 种不同转录产物的表达情况。包括已知在小鼠耳泡中表 达的转录产物，在一项独立研究中发现的潜在新型耳泡富集性转录产物，以及与内耳发育 过程中涉及的五种主要信号通路有关的基因（Fgf, Shh, Notch, 经典 Wnt, Tgf） （Table S1） 。 每种引物配对的性能都验证过其技术上的可重复性，以及特殊信号的产生（Fig.S2 and “Primer Validation” in Extended Experimental Procedures） 。我们分析了 36864 份个体 qPCR 测定中的单细胞 cDNA。382 个细胞都经过了一些严格的质控评估，确保了单细胞数据的高 质量，并且这些细胞被用在后续分析中（Fig.S3 and “质控与初始数据处理” in Extended Experimental Procedures） 。 耳泡细胞与神经母细胞在单细胞转录分布情况上的差别 神经母细胞的特化是内耳发育过程中最早的细胞命运决定之一。耳泡藏有的前体细胞 会从腹前区域（ventro-anterior ）分层出来，并向腹部- 中部迁移，聚集在该处，增殖并分 化，形成神经元，支配内耳的耳蜗和前庭器官（Rubel and Frizsch, 2002） 。这一分层与迁移 的过程从胚胎期第 9.5 天开始，持续至少 1.5 天，到胚胎期 11 天结束（Kim et al., 2001; Ma et al.,1998） 。神经母细胞表达一定数量的标志基因，比如 Neurog1（Ma et al.,1998） ， Neurod1（Liu et al.,2000） ，以及 Isl1（Li et al.,2004） 。在 E10.5 时，我们预期能够同时游离 出正在分层的神经母细胞和正在迁移的神经母细胞，并且预计可以通过这些细胞截然不同 的基因表达模式，把它们和耳泡细胞区分开来。 为了区分神经母细胞和耳泡细胞，我们比较了所有 382 个细胞 92 个基因的转录分布情 况。我们使用 Pearson 相关系数（Peason, 1896）作为评定所有细胞个体表达分布情况间相 似度的工具，并作出一个反映每个个体细胞与其它所有细胞关系的热图（heat map） 。两个 完全不同细胞簇，我们命名为 A1（由 110 个细胞组成）和 A2（由 272 个细胞组成）之间 显示出了相关性（Fig.1C） 。在一项平行且独立的数学分析中，我们使用了主要成分分析 （PCA） （Jolliffe, 2002; Yeung and Ruzzo, 2001）以区别不同的细胞群。PCA 是一种多元统计 技术，通过在一个再变形的多维空间中确定一个新的坐标并选择一个较小的但仍然拥有原 始多维数据中变异的坐标集合，降低了数据的维度（这里 92 个基因96 减去 4 个对照基因 分别对应 92 个维度） 。PCA 使得在较低维的空间中也能识别图案（pattern） 。我们发现前两 个主要成分保留有数据中原始生物变异的 35.12%，这足以区分两个分别对应于 Peason 分 析中 A1 和 A2 群的细胞群（Fig.S4A and 1D） 。 双聚类分析（Bi-clustering anaylsis）进一步细分了耳泡细胞群和神经母细胞群 由 Peason 相关分析做出来的热图，对其进行肉眼检查，提示这两个主要的细胞群还可 以进一步细分。因此我们使用了双聚类分析，这是一种无偏倚的划分方法，可以同时聚类 基因和细胞。它更多地是解决了局部而非全局的基因关联类型，因此可以在细胞不同亚群 间，识别出表达类型相同的基因亚群（Cheng and Church, 2000） 。Fig.2A 显示了由双聚类算 法产生的热图，该图将数据归为六个细胞聚类，定为 B1-B6。B1 和 B3 分别由 50 和 65 个细 胞组成，并且包含了所有之前用 Peason 相关分析和 PCA 识别出来的 110 个 A1 细胞 （Fig.2B） 。亚聚类的总体组织强化了这样一个观点，即耳泡细胞和神经母细胞的总体细胞 异质性可以通过计算组织成转录上和/或功能上相关的细胞群。这六个细胞聚类中的每一个， 是由不同基因亚群的分化表达形成一种相关方式来确定的。聚类 B1 和 B3 显示其背部耳泡 标志基因完全缺失，并且主要是由神经母细胞标志基因的存在而被划为一类，这一点已经 为 Peason 相关分析和 PCA 所提示。有趣的是，在神经母细胞分层早期阶段表达的标志基 因，比如说 Neurog1 和 Fgf3（Hatch et al.,2007; Ma et al.,1998） 在 B1 细胞中大部分得到表 达，而在迁移和分层后神经母细胞中找到的那些基因，比如 Isl1，Neurod1，以及 Eya1（Li et al.,2004; Liu et al.,2000; Radde-Gallwitz et al.,2004） ，形成的转录因子勾画出了 B3 细胞聚 类。另外，特定描述了 B2 聚类的那些基因，在 B3 细胞聚类中表达少（ Fig.2A，B1 到 B3 间 的框） 。基于这些观察结果，我们猜想 B1 由早期神经母细胞组成，而 B3 聚集的是具有晚 期神经母细胞特性的细胞（Fig.2C） 。 B2 聚类由 93 个细胞组成，表达腹部相关标志基因，包括感觉前基因（prosensory genes）Lfng， Sox2，以及中部标志基因 Pax2，以及音猬因子（Shh）信号通路效应子 Gli1（Dabdoub et al.,2008; Morsli et al.,1998; Riccomagno et al.,2002） 。这提示了它们可能是 腹部- 中部耳泡细胞的起源，而背部相关基因比如说 Oc90 和 Dlx5 的缺失或低表达支持了这 一点（Depew et al.,1999; Verpy et al.,1999） （Fig.2C） 。 B4 聚类中的细胞被归为背部耳泡细胞，其特征是腹部相关基因与神经母细胞标志基因 缺失，而据报道是背部表达域的那些基因则强烈表达，比如 Bmp4，Dlx5 ， Gata2，Oc90（Fekete and Wu, 2002; Lillevali et al.,2004; Zheng et al.,2003） 。 B5 聚类细胞的特征由一大堆基因来描述，其中有些主要与耳泡相关，与正在分层的神 经母细胞没有特别关系。而大部分基因表达得更为广泛，这使得很难为它们指派特定的表 达域特性。 最后，B6 聚类代表着一个完全不同的细胞亚群，只有它们表达 Wnt/b-catenin 家族的 成员（Wnt2b ， Wnt7a，Wnt7b ） 。Wnt2b 据报道可以特异性标记内淋巴管区域（Hatch et al.,2007; Koo et al.,2009; Lin et al.,2005; Riccomagno et al.,2002） 。B6 中的细胞也表达背部基 因 Oc90 和 Dlx5，以及中部标记基因 Gbx2（Hidalgo-Sanchez et al.,2000） ，提示它们可能源 自这些区域。 上述的双聚类分析使得我们可以识别出那些与个体细胞聚类相关的基因。接下来我们 试图在所有 382 个细胞个体中直接比较这些定义基因的选定集合。Fig.2D 显示了 6 个直接 比较的例子，每个例子比较 3 个聚类相关基因（颜色编码如 2C 所示） ，以及一个对照基因 （灰色） ，该对照基因在相应的聚类中一般是缺失或低表达的（见 Fig.S5 以了解详细清单） 。 举例来说，在 B1 中，细胞表达早期神经母细胞基因 Neurog1（各个细胞按照其表达水平降 序排列） ，这种细胞一般来说不表达背部标志基因 Oc90。另外，Fgf3 和 Fgf8 的表达与 Neurog1+细胞部分相关。 B2 聚类的特征标志基因 lunatic fringe 在 B2 中大约 59%的细胞中表达，其中大部分细 胞不表达或低表达 Oc90。感觉前标志基因 Sox2，腹部-中部标志基因 Pax2，以及音猬相关 标志基因 Gli1 的表达分布情况，与 B2 聚类的非神经性，腹部耳泡特性相一致（Fig.2D and S5B） 。B3 标志基因 Neurod1，Isl1 以及 Eya2 的分布情况显示 Neurod1 在 B3 中一个独特的 细胞亚群中表达，呈现单峰表达。至于说 Oc90，Neurod1 的表达本质上与其是相互排斥的， B3 聚类中只有极少数细胞同时表达两种标志基因。Isl1 和 Eya2（细胞按 Neurod1 转录水平 排列）表现出双峰表达行为（Fig.2D 另见 Fig.S6） 。而大部分阳性表达这两种基因的细胞也 表达 Neurod1，存在少量的 Isl1+/Neurod1-和 Eya2+/Neurod1-细胞群；与 Neurod1+细胞群相 比，这些细胞一般在低水平上表达 Isl1 和 Eya2（Fig.2D and S5C） 。 B4 相关基因的分析，及其在所有细胞中表达情况与腹部标志基因 Lfng 表达情况的对比 突出了 Oc90， Dlx5 以及 Gata2 之间的相关性。在 Oc90+细胞中有一个特殊亚群，大部分是 Lfng 阴性，它们也表达背部标志基因 Dlx5（尽管也存在少量 Oc90-/Dlx5+细胞群） 。高水平 表达 Gata2 的细胞中大部分也表达 Oc90，而 Gata2 的表达与 Neurod1 的表达相互排斥 （Fig.2D and S5D） 。与之相比，那些在 B5 聚类中作为细胞特征的基因中大部分表达更为广 泛，并且是以类似梯度变化的方式表达。细胞被根据 Lmx1a 表达水平来分类，显示出 Sox10 与 Fgfr2 之间的转录相关性。其它标志基因之间的附加并列识别出了更加详细的分类 表达类型（Fig.S5E） 。最后， B6 细胞代表着一种独特的 Wnt 活化细胞亚群，其专门共表达 内淋巴管标志基因 Wnt2b 及新识别的 Wnt7a，但不表达 Wnt7b，也阳性表达 Emx2，该因 子之前用原位杂交技术没有在耳泡中发现过（Holley et al.,2010） （Fig.2D and S5F） 。 总而言之，双聚类分析显示出耳泡和神经母细胞中不同的亚群。逐个基因分析及逐个 细胞分析暴露出了极为有趣且深入的相关关系，但它没有在耳部发育过程中发现与以前不 同的相互关系。这促进了一种分析策略，利用该策略我们用已知的基因表达信息来确定模 型，在该模型中，单个细胞可以被归到特定的发育阶段中，并且/或归到其在耳泡内的原始 空间环境中。 由网络分析及一维 PCA 显示出的神经母细胞成熟过程中的时间动态 神经母细胞起自耳泡的腹部-前部区域，在那里它们分层并形成耳蜗-前庭神经节 （Fritzsch et al.,2002; Kim et al.,2001; Ma et al.,1998） 。基于双聚类分析的结果，我们假定神 经元相关性细胞的两个亚聚类代表着时间上两个不同的神经母细胞池，一个是较早期的神 经祖细胞群（B1 ） ，一个是发育时间更长的细胞群（ B3） 。神经母细胞的分化是一个动态的 过程，在这个过程中，细胞分层，迁移，增殖，以及分化。为了直接观察到 B1 相关和 B3 相关细胞的发育，我们假定处于相同分化阶段的细胞会显示有可比性的基因表达类型，通 过高度共表达评分识别，用 Peason 相关分析进行确定。将有高度共表达评分的细胞联系起 来，我们建立了一个分化时期相似性网络，由 115 个 B1 和 B3 细胞组成（Fig.3A “网络形 成与拓扑分析”请见 Extended Experimental Procedures） 。时期相似性网络的拓扑分析 （Girvan and Newmann, 2002）显示出了三个不同的团体细胞群（community group） （命名 为 C1C3） ，与之前确定的双聚类 B1 和 B3 相关（Fig.3B） 。C1 和 C3 细胞群排它性地分别含 有 B1 和 B3 聚类中的细胞，与神经母细胞发育过程中的早期和晚期阶段相一致。C2 细胞群 从拓扑学上介于 C1 和 C3 之间，由 B1 和 B3 细胞对称分布组成。有趣的是，C2 中一个较小 的相互联系的细胞群（Fig.3A 中的虚线圆圈）被预先划分在“晚期神经母细胞”聚类 B3 中 提示它们在时间上的特征，与位于 C2 团体细胞群左侧的可能 “更年轻”的 B1 细胞是完全 不同的。这一网络拓扑结构，及其与聚类的相关关系，与 C2 代表着耳部神经生成过程中一 种过渡状态的情况一致。 为了确认网络拓扑学分析的结果，我们研究了与神经母细胞成熟过程不同时期有关的 个体标志基因的表达水平。bHLH 转录因子 Neurog1 是一个神经母细胞早期标志因子，为神 经母细胞的特化所必需（Ma et al.,1998） 。在神经发生过程结束时，以及神经母细胞的生存 中需要 Neurod1（Liu et al.,2000） 。LIM-同源结构域转录因子 Isl1 于分层期间在神经母细胞 中表达，也在成熟听神经元和前庭神经元中表达（Li et al.,2004; Radde-Gallwitz et al.,2004） 。 C1 中细胞表达 Neurog1 的水平比其它两个团体细胞群中的细胞表达水平高 3 倍，差异有统 计学意义（Fig.3C，内容与图不符） 。此外，C1 中 93.3%的细胞阳性表达 Neurog1，这一点 与 C2 和 C3 中的细胞不同（阳性率分别为 65.9%和 50.0%） 。Neurod1 在耳部神经生成过程 中起的作用更为长久，与此相一致的是，它几乎在三个细胞群的每个细胞中都表达出高转 录水平，细胞群之间表达水平没有差异，另一方面，Isl1 在“晚期神经母细胞”-相关性细 胞群 C3 中的表达水平，比它在“早期神经母细胞”相关性细胞群 C1 细胞中的表达水平高 了 20 倍，在 C2 中的表达水平与 C1 比，也显著增高了。这些发现支持了一个结论，即用 于网络拓扑分析的 115 个细胞代表了早期，中期以及晚期动态变化过程中的内耳神经母细 胞谱系。 将神经母细胞归到发育过程中假设的各个时期中的能力，促使我们将 PCA 限定用在单 一维度上，在我们假设的这个维度上主要代表时间轴，可以按一种更为连续的方式显示出 动态表达分布情况。第一个主要成分（PC1）信息量巨大，与对其它细胞群的分析结果相 比，保有更多部分的数据中的原始变异性（Fig.S4B） 。细胞沿 PC1 轴排列的序列与较早的双 聚类分析结果高度相关，在双聚类分析中我们把左侧的细胞归为 B1，标志着“早期” ，而 被定为 B3 相关的细胞沿矢量线的右侧段散布，我们称之为 “晚期” （Fig.3D） 。 我们接下来检测了我们的单一维度神经母细胞群模型在生物学上的有效性，方法是沿 着 PC1 轴，检测选定的发育相关基因的表达水平（Fig.3E-3K） 。 相关标志基因的分布情况证实了之前对 Neurog1，Neurod1 以及 Isl1 的发现，显示出 Neurog1 和 Isl1 一般来说是以相反的方式表达的。最高程度表达早期神经母细胞标志基因 的细胞向左侧分布，而高度表达 Isl1 的细胞聚集在第一成分矢量（first component vector） 的右侧（Fig.3E） 。由于每个细胞沿轴的位置都是用于分析的所有 92 个基因分布情况的综合 结果，所以我们可以用单一维度的结果来探询其它基因是如何沿神经母细胞谱系发展模型 表达的（完整表格请见 Fig.S7A） 。举例来说，神经营养因子 Ntf3 和 Bdnf 对于晚期内耳神经 元的生存是必须的（Fritzsch et al.,2005） ，但在耳泡中，以及正在分化的神经母细胞中，它 们的表达及作用还不是很清楚。这两种因子在每个非常早期的神经母细胞中充分表达，然 后下降，到耳部神经生成晚期降到低水平或是缺失。 与细胞从耳泡中分层并迁移到神经母细胞谱系的情况相一致，感觉前标志基因 Lfng，Jag1 ，以及 Sox2（Brooker et al.,2006; Hartman et al.,2010; Kiernan et al.,2005）随着神 经母细胞的不断发育，而沿时间轴下调（Fig.3F ） 。在早期神经母细胞中， Lfng 的表达迅速 下降到缺失，而 Jag1 和 Sox2 沿此轴的下调速度稍微低一些。 对代表主要信号通路的基因进行分析，使得我们可以将已有的文献数据联系起来，并 剥离出可能的功能调控机制。正如所料（Bok et al.,2007） ，在我们阵列中分析的耳泡细胞和 神经母细胞中，Shh 表达主要是缺失的（Fig.3G） 。但是， Shh 受体基因 Smo 和 Ptc2，及其 效应子 Gli3 是表达的，并且在具有晚期神经母细胞特征的细胞中是下调的。这提示，一旦 神经母细胞接受了它们的谱系身份，它们就丧失了对 Shh 的反应。 而 115 个细胞中没有细胞表达任何我们检测的 Wnt 基因，Frizzled 基因及效应子 Axin2（轴蛋白 2）的表达测绘图支持了这样一种假说，即神经母细胞随着其发育完成，对 Wnt 信号通路变得失去反应（Fig.3H） 。这与之前的报导相一致，之前有报道称说在 Shh-/-小 鼠中对 Wnt 信号通路反应性的增高引起 Neurog1 表达抑制以及神经母细胞发育的失败 （Brown and Epstein,2011） 。即，Wnt 反应性的丧失似乎允许了神经母细胞的发育完成，我 们的单细胞分析显示 frizzled 基因表达的丧失及 Wnt 效应子基因表达的减少是一种机制， 该机制参与确保恰当的神经母细胞谱系的发育。 Notch 信号通路在调控内耳中神经前体细胞的早期区域化与发育中起作用（Abello et al.,2007; Daudet et al.,2007） 。我们发现神经母细胞群在某些 Notch 相关基因上表现出了动 态表达，与 PC1 轴上神经元分化过程的时间梯度相一致。特别是，早期神经母细胞富含 D 1， Jag1 和 Notch2 配体，以及效应子 Hes1，Hes5 ，以及 Hey2（Fig.3I and S7A） 。这些 Notch 基因的表达沿 PC1 时间轴下降，Notch2 及其效应子比配体（ D1 和 Jag1）下降得更 快。有趣的是，Notch1 仅在少数早期神经母细胞中被发现，表现出与 Notch2 互相排斥， 提示细胞上的受体受到了不同的调控（Fig.S7A） 。与上述 Notch 基因相比，配体 Jag2 及效 应子 Hey1 沿着 PC1 不下降，反倒是轻度升高，提示这些特殊的 Notch 基因可能在听觉及 前庭神经节发育过程的晚期阶段起作用。 潜在的亚群细胞向神经母细胞发育晚期阶段发育的出现，显示了我们的解释存在一个 重要的限制，即单一基本成分轴代表着一条时间线。尽管连续的发育过程很可能是细胞沿 这条轴排列的一个重要因素，我们也无法排除神经母细胞谱系发散成了多种细胞类型。实 际上，人们可以预见到这样一次分裂，据报道最早出现在 E12 时，前庭神经节和听神经节 分离，这是目前研究过的最早的时间节点（Lu et al.,2011） 。我们的数据显示有些基因，包 括 Foxg1 和 Jag2，在 PC1 轴上与晚期神经母细胞发育相对应的细胞群中强烈表达（Fig.S7A） 。 这促使我们将注意力集中到晚期神经母细胞群上（B3） 。二维 PCA 识别出了 B3 中两个不同 的晚期神经母细胞群，特点是 Foxg1 和 Jag2 的非对称分布（Fig.S7B and S7C） 。尽管是推测， 但这两个细胞群可能提示了早期前庭神经节与螺旋神经节神经元的分离。螺旋神经节与前 庭神经节的基因表达分布情况分析发现 Foxg1 和 Jag 在表达上有区别，这种区别最早出现 在 E12（Lu et al.,2011） 。 说到 Fgf 信号通路，我们注意到 Fgf8 和 Fgf10，在前述假定的发育时间轴上更邻近早期 和中期的细胞中表达程度更高（Fig.3J） 。Fgf 受体 1（Fgfr1）及其拮抗剂 Spry2 的分布情况 是相反的，Fgfr1 在具有早期神经母细胞身份的细胞中高表达，随时间下降，而 Spry2 的表 达随时间上升，在晚期神经母细胞状态的细胞中表达程度更高。我们研究的其它 Fgf 信号 通路成员没有表现出这样明显的分布差异（Fig.S7A） 。关键耳部 Fgfs，主要的受体，以及主 要的拮抗剂在表达上的不同变化，在与鸡耳部神经母细胞中的发现相一致，该发现表明 Fgf 信号通路对于神经母细胞命运决定期间的早期事件是必需的（Alsina et al.,2004） 。晚期神经 母细胞阶段 Fgf 配体及受体的缺失，以及 Spry2 的上调，提示 Fgf 信号通路在发育的这一阶 段终止了。 Tgf- 信号通路基因表达情况中最显著的变化可用抑制剂 noggin 来察觉，它在神经母 细胞发育早期高表达，然后下降，到神经母细胞晚期阶段时缺失（Fig.3K） 。在晚期神经母 细胞中，与较早期神经母细胞中相比，活化素受体 2B 型的表达水平下降了，而 Bmpr2 的 表达水平从中等水平增加到了高水平。Bmp4 拮抗剂 noggin 和 Bmp 受体 2 的这种相反的表 达模式提示 Tgf 信号通路在晚期阶段细胞的神经母细胞身份特化过程中有积极作用。 耳泡的三维重建 耳泡的形态像一个球形，并且含有转录上不同的表达区域，这些表达区域一般跟三个 主要体轴中的至少一个有关系，这三个主要体轴是背部/腹部轴，内侧/外侧轴，以及前后 轴。到目前为止，对转录上活跃区域的分层一般还是低通量的，在二维空间中进行。我们 试图在三维空间中描述所有受测基因的表达区域。为了实现这一目的，我们对 267 个非神 经母细胞聚类的 B2 及 B4B6 细胞（Fig.2A and 2B）进行了 PCA。下一步，我们在单细胞基 因表达数据的辅助下将这 267 个细胞分别投射到三维坐标系统中一个球体的表面，并估算 出了三条主要的体轴，这种单细胞基因表达数据中基因的表达范围被限定在耳泡的某一侧。 由于我们选择了检测的某些基因来定义已知的表达区域，比如背侧（Oc90）以及内侧 （Gbx2 ） ，我们得以定义三条主轴（Fig.4A “PCA 数据的三维投射”请见 Extended Experimental Procedures） 。为了评估基于 PC 坐标的 3D 投射是否能完成耳泡的粗略重建， 我们直接观察了标志基因的量化表达，并分析了表达标志基因的细胞在球上的局限情况 （Fig.4B 以及网上的短片 S1S4） 。 我们发现背部标志基因 Oc90 及 Dlx，以及内淋巴管标志基因 Wnt2b 主要投射在球模型 的背部半球，与它们在腹部半球的表达水平相比，有显著的差异，分别是 9.8 倍，3.9 倍和 36.8 倍（ Fig.4C） 。相反，我们发现腹部标志基因比如 Lfng 和 Sox2 标志的是那些位于腹侧 的细胞。Lfng 几乎是排他性地在腹侧耳泡细胞中表达，与文献中的表达数据精确相关 （Hurd et al.,2010） 。Sox2 实际上在所有细胞中都有发现，但与背侧半球细胞相比，其在那 些位于投射腹侧的细胞中的表达要显著高出 3.3 倍。Pax2 表达情况的分析显示其在内侧细 胞中的表达要高出 4.1 倍，这与之前的报导相符（Zheng et al.,2003） 。 对已报导的在内侧表达的标志基因，比如 Gbx2 和 Lmx1a（Koo et al.,2009; Lin et al.,2005）进行分析，显示出了用传统方法之前无法发现的表达上的细微差别。Gbx2 的表 达限于那些位于耳泡内侧半球的细胞，我们还发现该标志基因有一种趋势，在那些表达背 侧标志基因的耳泡细胞中表达程度较高（Fig.4C）之前有报道 Lmx1a 是大部分耳泡细胞的 一般标志基因，除了内侧-前侧区域（Koo et al.,2009） 。我们的分析证实了这一基因在大部 分耳泡细胞中表达，但也显示 Lmx1a 在内侧区域中表达程度最高（与外侧半球相比高了 3.9 倍） 。最后，我们发现表达神经母细胞相关基因 Ntf3， Neurog1 以及 Neurod1 的细胞位 于投射球的腹侧半球，这与已发表的报导相一致（Fritzsch, 2003） 。这些细胞会成为那些定 居在腹侧的耳泡细胞，它们尚未完全转变到神经母细胞谱系中。 在确认了 3D 模型的空间精确性之后，我们验证了这个模型定义小鼠耳泡中之前没有 被描述过的那些基因表达区域的能力，比如说 Ap1m2，Fbxo2，以及 Otol1（Fig.4B and 4C） 。 Ap1m2 实际上在所有细胞中表达，在内侧-前侧区域要稍微高一点点；该基因随着神经母细 胞成熟而下调（Fig.S7A ） ，另一方面， Fbxo2 和 Otol1 在空间上的表达更好定义一些，它们 在内侧和腹侧区域高表达，强烈提示它们与那些最终会随着发育的继续而形成感觉前区域 的细胞有关。 三条主要体轴的确定将耳泡分成了六个明确的半球（背侧，腹侧，内侧，外侧，前侧， 后侧） ，并且代表了一个机会，可以进一步将耳泡分成不同的八分球体（Fig.4D） 。这使得我 们可以显示出每个八分球体中表达某种基因的细胞的数量，以及某给定基因的平均表达水 平。举例来说，Pax2 在模型的内侧八分球体中显著高表达（p0.0001，八分球体 36） （Fig.4D ） 。另外，我们确定了感觉前标志基因 Lfng 和 Sox2 的表达区域，它们都是在所有 4 个与耳泡内侧半球对应的八分球体中高表达。在八分球体 5 和 8 中表达程度最高，这两 个八分球体对应的是腹侧-前侧（Fig.4D and see Table S2） 。表达 Fbxo2 和 Otol1 的细胞，这 两个是来自我们的独立微阵列研究中的耳部特异性参与基因，分别主要位于内前侧和腹内 前侧区域。提示耳泡的这一将要形成未来的感觉前区域的部分存在某种程度的异质性。 为了进一步仔细检查这个模型的精确度，我们测定了每一个基因在所有八分球体中基 因表达分布情况，并与文献中已经报导的数据做对比。我们计算了“表达积分” ，它把阳性 表达某种标志基因的细胞的比例，及其相关转录水平都计算进来了。结果是，几乎所有的 受测基因都表现出了正确的表达分布，如同 3D 耳泡模型中确定的那样（见 Table S2） 。 可以在耳泡的某个确定的空间区域内测绘出信号通路 我们使用重建的耳泡中的八分球体节段，通过识别出充当起源者和/或下列信号通路接 受者的细胞群，来勾勒出信号通路。这些通路包括：Notch，Shh，Fgf，Tgf，以及 Wnt。 Notch 信号通路在耳部发育过程的至少两种主要形式中很重要（Murata et al.,2012） ， 但没有彻底分析过其在耳泡阶段的作用。我们的分析在两个不同的空间上封闭的区域中测 绘出 Notch 通路（Fig.5A and 5B） ，一个是背侧-前侧区域（Notch2 ） ，一个是腹侧-前侧区域 （Hes1，Hey1 ，Hey2） 。有些 Notch 信号通路相关基因在神经生成及感觉前祖细胞中表达， 一般局限于腹侧- 内侧- 前侧区域。因此，对于腹侧- 前侧空间区域的预言，和已知 Notch 这 种程度的活跃相一致。据报道 Notch2 在早期耳泡中表达，这一基因的突变引起正在发育的 耳部凋亡增加，但 Notch2 表达的精确模式还没有搞清楚（ Hamada et al.,1999） 。 没有受测细胞表达 Shh，这与已经发表的数据相一致，有报道称脊索和底板是 Shh 的 唯一来源（Bok et al.,2007; Riccomagno et al.,2002） 。Shh 受体基因 Ptc2，和效应子基因 Gli3 一样，主要在耳泡模型中位于腹侧半球的细胞中表达（Fig.5C） 。对于 Gli1 和 Gli2 而言，其 表达程度最高的区域分别向背侧和前侧延伸。 Fgf 信号通路在耳泡腹部区域中神经母细胞的特化中起重要作用（Alsina et al.,2004） 。 我们的分析显示 Fgf3 和 Fgf10 是由居于耳泡腹侧-外侧-前侧的一股细胞产生的。细胞自主 性 Fgf 信号通路拮抗剂 Spry1 的表达限于更内侧的一个区域，而表达 Fgfr1，Fgfr2 以及 Fgfr3 的细胞分别位于内前侧，背内侧以及外前侧（Fig.5D） 。 Tgf 信号通路在内耳发育过程中的作用还没有被详细阐明，仅仅是在 Bmp 信号通路 的背景下被有选择性地描述过（Chang et al.,1999; Gerlach et al.,2000; Merlo et al.,2002） 。我 们确认并改良了之前报导过的 Bmp4 的表达模式，之前报导说它的表达限于小鼠耳泡的背 外侧。我们的分析将表达 Bmp4 的细胞定位在了背侧-外侧 -前侧区域（Fig.5E） 。Bmpr2 的表 达主要是在那些位于内前侧区域的细胞中发现，这与 Acvr2b 类似。卵泡抑素是一种细胞分 泌的蛋白质，调控 Tgf 家族成员的活性，它被居于耳泡背侧-内侧-后侧区域的特定细胞群 分泌出来。不过，Bmp 的拮抗剂 Chordin 由位于耳泡外侧 -后侧区域的细胞分泌。这些发现 表明 Tgf 信号通路在耳泡的不同区域是有潜在活性的。 倾向于定居在 3D 模型背侧- 内侧 -前侧区域的细胞表达各种 Wnt 受体 （Fzd1，Fzd6，Fzd7，Fzd10） ，并最高程度地表达效应子基因 Axin2，提示它们处在接受 Wnt 信号的活化状态（Fig.5F ） 。Fzd2 ，Fzd8 以及 Fzd9 在耳泡腹侧-前侧区域表达程度最高。 位于背侧的 Wnt-信号受体细胞可能对来自背侧后脑的 Wnt1 和 Wnt3a 起反应（Riccomagno et al.,2005） 。另一群细胞共表达 Wnt2b 和 Wnt7a，特化了另一个细胞亚群，该细胞亚群位 于背侧-内侧-后侧。已知内淋巴管的特征是 Wnt2b，这提示 3D 耳泡模型中这一区域象征着 膜迷路的非感觉成分部分，该部分这一时期看起来像是透明贴膜。 一个独特的腹侧相关性细胞亚群的识别，该亚群可能是感觉前细胞的前体 我们试图找到这样一个细胞池，该细胞池有能力产生感觉前结构，该结构之后会分化 成前庭细胞和听毛细胞，以及支持细胞。我们的注意力集中在腹侧耳泡细胞 B2 上（Fig.2C ） 。 由双聚类分析作出的热图表明这个细胞群代表着一种异质性细胞的混合（Fig.2A） ，我们假 设 93 个 B2 相关细胞中只有一部分是感觉前区域细胞的前体。下一步，我们将数据输入计 算机，并可视化了所有耳泡相关细胞的共表达网络（Fig.6A） 。拓扑学分析（Girvan and Newman, 2002）识别出了一个数目为 22 的细胞群，我们将它称为 B2a，它与网络中心的大 量细胞截然不同，提示它有潜在不同的发育定向状态（Fig.6B） 。 我们研究了两种情况，在这两种情况中，这一群细胞代表着一个非常早期的神经前前 体细胞，要么按神经母细胞发育模式发展，要么就按不同的，非神经细胞群的模式发展。 所有 382 个细胞的网络结构证实了后者是对的，因为神经母细胞相关性细胞（B1）和非神 经母细胞相关性细胞之间的连结分布情况是由一群不同于分散的 B2a 群的细胞所确定的 （Fig.6C ） 。我们比较了 B2a 和其余 B2 细胞之间，以及与 B1 细胞之间所有 96 个基因的转 录水平。Fig.6D 显示，在这两组对比中，感觉前基因 Jag1，Sox2 和 Lfng 与 B2a 聚类相关。 此外，Neurog1 ，它对神经母细胞的成功定向是必需的，在 B2a 细胞中，与其它两组细胞相 比，表达程度是下调的。B2a 细胞主要位于我们的耳泡模型的腹侧- 前侧区域（Fig.6E ） 。 我们注意到假定的前感觉前（pre-prosensory）B2a 细胞表达 Hey1，Hey2，Hes1 以及 Hes5，还有 D1，Jag1 和 Notch2，反映出它有 Notch 信号通路活性（Fig.6D） 。同样，Shh 信号通路的介导因子 Gli2，Gli3 以及 Smo 也与 B2a 细胞相关。最后， Fgf3 和 Fgf10，以及 Spry1 与 Spry2 的表达增高，提示 B2a 细胞可能充当 Fgfs 的来源，但可能以一种细胞自主性 的方式拮抗 Fgf 信号通路。这些发现联合起来，提出了一个模型，在这个模型中，感觉前 区域形成的初始阶段中 Notch 信号通路是激活的，对 Shh 的反应性也是持续的，还有细胞 内源性 Fgf 信号通路抑制。这与人们认为的 Notch 信号通路维持或扩展感觉前斑块的作用 相一致（Hartman et al.,2010; Murata et al.,2006; Neves et al.,2011） ，也与神经母细胞中介导 Shh 反应的基因出现下调这一观察事实相吻合（Brown and Epstein, 2011; Riccomagno et al.,2002） （Fig.4G ） 。而 Notch 信号对感觉前区域的诱导可能没有作用（ Basch et al.,2011; Kieman et al.,2006） ，我们的数据提示腹侧耳泡中的细胞个体同时整合多种信号，提示在推 测的许可信号与部分诱导信号间存在复杂的平衡，造就了这一区域感觉前谱系和神经母细 胞谱系的确定。 DISCUSSION 单细胞定量 RT-PCR 是一种迅猛发展的方法，承载着给生物和医学许多方面带来恩泽的 希望（Kalisky and Quake, 2011） 。传统的研究基因表达的方法一般受限于成池细胞群，或是 集中关注组织，在组织中个体基因的表达程度可以通过评估转录水平或蛋白质水平来估计。 利用表达阵列以及 RNA 深度测序技术，已经在成池细胞群中分析了许多基因。这些方法的 限制是测定对象为细胞群而非个体细胞。原位杂交技术和免疫组化技术提供的是细胞个体 的信息，但缺陷是测定对象为一大票基因。将高通量与细胞精度整合起来，代表了一种完 美的观念，可以研究那些有不同生物学特征的较少的细胞衍生体。但是，到目前为止，这 需要将目标组织解离，这就造成了关键的空间信息丢失。我们的分析策略，通过在数学上 对（神经母细胞）发育成熟过程以及（耳泡）三维器官系统进行重构建模，从而将已知的 空间和时间上的基因表达信息融合了起来。我们使用小鼠耳泡，即内耳的原基，是因为其 中存在着一个能够定义了主要体轴的广泛表达域的简单遗传图，图上有多种了解得比较清 楚的基因。关于非对称表达基因的知识，比如正在分层的神经母细胞谱系的标志基因，耳 泡腹侧感觉前区域的前体基因（Brooker et al.,2006; Kierman et al.,2005） ，或是位于内淋巴 管的背侧基因（Hatch et al.,2007; Koo et al.,2009; Lin et al.,2005; Riccomagno et al.,2002） ，为 3D 模型中重建细胞谱系关系以及耳泡细胞个体的位置提供了框架。 我们的分析显示，我们归为神经母细胞的这一类细胞表现出一种短暂的特点。第一个 主要成分与时间变化之间的联系使我们可以在一维主成分矢量上研究这种短暂变化。这一 富含信息的分析的精确度，与已有的基因表达数据一致，并在高通量背景下，在单细胞精 度上，显示出许多以前未曾描述过的基因的动态情况。最后，将这种分析方法与应用型转 基因小鼠模型联合运用，无疑会对发育生物学及其它领域带来深远的影响。 EXPERIMENTAL PROCEDURES 耳泡和神经母细胞的分离 Pax2Cre+/-雄性小鼠与 Gt(ROSA)26SormtdTomato,mEGFP 雌性小鼠相配，每日检查阴道栓。在阴 道栓为阳性后（E0.5） ，于 10 日后处死雌性小鼠，游离出胚胎（E10.5） 。来自同一母体内的 胚胎（n=6）在冰冻 Hank 平衡盐溶液（HBSS）中进行显微解剖。使用荧光解剖显微镜核实 了成功的 Cre-介导重组。我们确定了所有 6 个用于研究的胚胎在总体大小，听囊完全闭合， 以及内淋巴管清晰呈现等方面是非常匹配的。听囊（总共 12 个）及其周围组织进行了显微 解剖，并在 37下用耐热菌蛋白酶处理 20 分钟以除去间质。组织用 HBSS 清洗 1 次并在 37 下用 Accutase 处理 30 分钟（Innovative Technologies） 。细胞被机械性弄散，用 HBSS 清洗 2 次。在进行细胞分类前，细胞悬浮液通过 35m 的滤器（BD Biosciences）以除去残 余的细胞凝集块。我们设计了门控策略，以最大化获取每孔单个活体细胞个体的能力 （Fig.S1） 。 由 FACS 进行细胞分类 细胞用碘化丙啶染色（Life Technologies）以排除死亡细胞，然后用 FACSARIA（BD Biosciences）进行分类。在移除碎屑及其它非细胞性颗粒后，用两个连续的门控步骤除去 双细胞团及多细胞团（前向散射高度FSC-H vs. 前向散射区域FSC-A ，侧向散射区域SSC-A vs. 侧向散射宽度SSC-W） 。在 SSC-A vs. PI 分布情况图中基于碘化丙啶（PI）摄取的识别过 程中去除死亡的细胞，EGFP+/tdTomato- 细胞个体被分类到 96 孔 PCR 平板中不同的孔内 （USA Scientific） ，这些孔内含有 CellDirect（细胞引导） 2 倍反应混合液（Invitrogen ） ，混 合液内有 0.05U 的 SUPERase-In RNase 抑制剂（Invitrogen ） 。流量恒定在 300cell/s（“精确” 设定在“单细胞” ，喷嘴，100m） ，然后立即封闭 96 孔平板，置于-80中储藏，用于后 续 RNA 过程。 RNA 过程及 qRT-PCR RNA was reverse transcribed in