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尊敬的中国微生态学杂志编辑： “金黄色葡萄球菌的耐药性分析及基因分型研究” 一文是由鲍宏 达等撰写的论著。该文通过实验分析了上海某大型医院的院内分离 菌株的耐药谱和基因型，并研究了菌株的亲缘关系，对防治强致病 多耐药型金黄色葡萄球菌在该院的流行提出了有针对性的意见和建 议。 敬请各位编辑给予指正，谢谢！ 文章第一作者：鲍宏达，男，1987 年生，研究方向：分子流行 病学 通讯作者：刘畅，Email: 我们保证该文章从未在任何公开杂志发表，也绝对没有一稿多 投。 金黄色葡萄球菌的耐药性分析及基因分型研究 鲍宏达 徐白莹 刘畅 韩立中 倪语星 郭晓奎 （上海交通大学医学院 上海 200025） 摘要 目的 通过分析上海地区院内分离金黄色葡萄球菌的药敏谱型及对耐甲氧西林的金黄色葡萄 球菌（MRSA）进行基因谱型的研究，了解金黄色葡萄球菌的院内流行状况。方法 对临床分离出 的 43 株金黄色葡萄球菌进行药敏试验和 SCCmec 基因盒的多重 PCR 检测，并将结果整合后用 MEGA3.1 软件分析其进化相关关系。结果 药敏结果显示 43 株金葡菌对青霉素和甲氧西林的耐药 率最高。甲氧西林的耐药率达到 62.8。MecA 阳性菌株 SCCmec 的分型显示均为 II 型或 III 型，且 所占比例相近，未见 I 型和 IV 型。进化树分析发现了在同一医院中亲缘关系相近的菌株，为院内感 染流行株。结论 MecA 基因介导的 MRSA 在分离菌株中所占比例高，存在院内感染爆发性流行。 关键词 耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、基因谱型、多重 PCR、耐药性、院内感染 Typing and phylogeny analysis of methcillin-resistant Staphylococcus aureus in nosocomial infections. Hong-da BAO，Bai-ying XU，Chang Liu，Li-zhong Han, Yu-xing Ni, Xiao- kui Guo (Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai, 200025 China) Abstract Objective To determine the antimicrobial susceptibility and molecular types among clinical isolates of Methcillin-resistant Staphylococcus aureus from different departments in Shanghai Ruijin hospital, and evaluate the prevalence of Staphylococcus aureus in nosocomial infections (NI). Methods Antimicrobial susceptibility of forty-three strains isolated from patients were examined by disc diffusion method; methicillin-resistant strains with mecA gene were typed by multiplex PCR method. MEGA3.1 software was applied to analyze the homology of the strains according to the susceptibility tests and the gene typing methods. Results The rates of the resistance to penicillin and methcillin is the highest, especially the resistant methcillin is up to 62.8%. SCCmec typing method gave the result that only type II and type III strains were discovered, none of the type I and type IV were found. Relative analysis showed phylogeny homologous strains exist. Conclusion Prevalence of certain types of mecA positive MRSA strains leading to epidemic outbreak. Key Words Methcillin-resistant Staphylococcus aureus; Genotype; multiplex PCR; antibiotic resistance；nosocomial infections 金黄色葡萄球菌（Staphlococcus aureus） ，简称金葡菌，是引起院内感染的重要革兰阳性病原菌 之一。近年来，随着抗生素的广泛使用，其耐药现象日益严重，导致临床诊断和用药困难，其中耐 甲氧西林金黄色葡萄球菌 (Methcillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) 引起的院内感染 (nosocomial infection) 已经成为全世界严重的公共卫生问题。建立快速、可靠的检测和分型方法，对 于相关卫生部门控制耐药菌株的流行具有非常重要的意义。MRSA的产生多数是由于获得了可转移 性耐药基因mecA，在mecA阳性的MRSA菌株复制起始点附近有一特征性结构，此结构内含有mecA 基 因，并可在以整体形式在不同菌株间相互传播，称为葡萄球菌染色体盒mec（(staphylococcal chromosome cassette，SCC mec） 。对SCCmec进行基因分型是一种重要的 MRSA的分型方法，目前国 际上研究主要可将MRSA分为五种型别1-3，对于MRSA的流行病学研究具有重要意义。 本研究对上海瑞金医院2007年7-8月临床分离的43株S.aureus进行药敏分型和SCCmec分型，并整 合两种分型方法分析了菌株间的亲缘关系，旨在对感染菌株的耐药特点和流行病学特征有所了解。 1 材料与方法 1.1. 菌株来源 2007 年 7-8 月上海交通大学医学院附属瑞金医院临床检验科收集的住院患者送检标 本（包括痰、咽拭子、尿、创面或伤口分泌物、血）中分离的医院感染菌株 43 株。质控菌株为金黄 色葡萄球菌 ATCC 25923，来自本教研室。 1.2 细菌鉴定 所有分离菌株经全自动细菌鉴定仪（法国梅里埃）API Staph 系统进行生化鉴定。 1.3 培养基和药敏纸片 MH 琼脂干粉培养基购自上海中科昆虫生物技术开发有限公司。所用的药敏 纸片包括庆大霉素(GM)、青霉素（P） 、甲氧西林（MET） 、优立新（SAM） 、头孢唑啉（CZ ） 、万古 霉素（VA） 、四环素（T） 、克林霉素（CL ） 、复方新诺明（SXT） 、磷霉素（FM） 、利福平（RA） 、 替考拉宁（TP） 、左氧沙星（ LVF） 。均购自美国 BD 公司。 1.4 药敏试验 采用 K-B 法测定 43 株菌对 13 种抗生素药物的药物敏感性，结果依据美国临床实验 室标准化委员会（NCCLS）2004 年版进行判读。结果分别标记为敏感（ S） 、中介（I ）和耐药（R ） 。 1.5 细菌 DNA 的制备 选择对甲氧西林耐药的菌株，吸取 1.5mL 的过夜培养菌液置于 Eppendorf 管中，离心沉淀后用小量细菌基因组抽提试剂盒（华舜）抽提细菌基因组 DNA 作为模板，按照试剂 盒的说明书操作。 1.6 基因分型 根据 Genebank 上 mecA 的基因序列设计引物 mecA1 和 mecA2，从耐甲氧西林的菌 株中筛选 mecA 阳性的样本。然后采用多重 PCR 的方法，设计针对 SCCmecI 型至 IV 型的 6 对引物， 进行葡萄球菌染色体盒分型（SCCmec） 。各种靶基因引物序列和产物长度列于表 1。PCR 扩增条件 均为：25L 反应体系，2Taq Master Mix (北京天根生化科技有限公司 ) 12.5L，上下游引物各 1L、模板 1L ，用 ddH2O 补至 25L。在 BIORAD PCR 扩增仪上设置扩增条件如下：95预变 性 4min, 94变性 30s, 55退火 30s, 72延伸 1min,共循环 30 次，最终 72延伸 4min。扩增产物取 10ul 进行 1.5%琼脂糖凝胶电泳。PCR 产物表现出 495bp 和 342bp 的为 I 型，表现出 342bp，284bp 和 209bp 的为 II 型，表现出 414bp，243bp 和 209bp 的为 III 型，只有一条 342bp 的是 IV 型。 表 1 靶基因 PCR 引物序列4 基因名称 引物名称 引物序列 产物长度 CIF CIF2 F2 TTCGAGTTGCTGATGAAGAAGG 495 CIF2 R2 ATTTACCACAAGGACTACCAGC KDP KDP F1 AATCATCTGCCATTGGTGATGC 284 KDP R1 CGAATGAAGTGAAAGAAAGTGG MEC MECI P2 ATCAAGACTTGCATTCAGGC 209 MECI P3 GCGGTTTCAATTCACTTGTC RIF4 RIF4 F3 GTGATTGTTCGAGATATGTGG 243 RIF4 R9 CGCTTTATCTGTATCTATCGC RIF5 RIF5 F10 TTCTTAAGTACACGCTGAATCG 414 RIF5 R13 GTCACAGTAATTCCATCAATGC DCS DCS F2 CATCCTATGATAGCTTGGTC 342 DCS R1 CTAAATCATAGCCATGACCG mecA MecA1 GTTGTAGTTGTCGGGTTTG 446 MecA2 TCCACATTGTTTCGGTCT 1.7 整合药敏试验和 SCCmec 分型结果，对 mecA 阳性的菌株用 MEGA3.1 软件进行菌株亲缘关系比 较，并构建进化树。 2 结果 2.1 细菌鉴定 经全自动细菌鉴定仪鉴定，43 株菌属于金黄色葡萄球菌种。 2.1 药敏试验 43 株金黄色葡萄球菌中有 27 株菌对甲氧西林耐药，MRSA 菌株占到 62.8。所以菌 株对其它 12 种抗生素的药敏试验结果见表 2,从表中可以看出，43 株菌对青霉素的耐药率最高，达 到 90.7，对替考拉宁的耐药率最低，仅 2.3。无万古霉素耐药菌株。 表 2 43 株金黄色葡萄球菌对 13 种药物的耐药性 抗菌药物 MRSA(n=27) MSSA(n=16) 总耐药率 (%) 庆大霉素 青霉素 优立新 头孢唑啉 万古霉素 四环素 克林霉素 复方新诺明 磷霉素 利福平 替考拉宁 左氧沙星 81.5（22/27） 100（27/27） 85.2（23/27） 92.6（25/27） 0（0/27） 88.9（24/27） 88.9（24/27） 33.3（9/27） 14.8（4/27） 44.4（12/27） 3.7（1/27） 74（20/27） 12.5（2/16） 75（12/16） 6.3（1/16） 0（0/0） 0（0/16） 18.8（3/16） 6.3（1/16） 0（0/16） 6.3（1/16） 0（0/16） 0（0/16） 0（0/16） 55.8（24/43 ） 90.7（29/43 ） 55.8（24/43 ） 58.1（25/43 ） 0（0/43） 62.8（27/43 ） 58.1（25/43 ） 20.9（9/43 ） 11.6（5/43 ） 25.6（12/43 ） 2.3（1/43） 46.5（20/43 ） 2.2 SCCmec 分型结果 43 株菌中对甲氧西林耐药的共有 27 株。经筛查，mecA 阳性的菌株为 24 株，占到 88.9。SCCmec 分型结果提示，在所有 mecA 阳性的菌株中，可检测出 II 型菌株 9 株，占 37.5；III 型菌株 15 株，占 62.5。未见 I 型和 IV 型菌株的存在。 2.3 整合后的菌株亲缘关系比较结果 将 mecA 阳性的 24 株菌结合药敏试验的分型结果，用 MEGA3.1 软件分析其同源性，构建进化树结果见图 1。 3 讨论 金黄色葡萄球菌是引起医院和社区感染的重要致病菌，随着抗生素的广泛应用和各种侵入性医 疗装置的应用，临床上耐药菌株不断增多，尤其是MRSA引起的院内感染，可引起爆发性流行，并 可远距离播散。对院内感染的MRSA菌株进行耐药谱分析和基因分型对于控制MRSA的院内传播和爆 发具有重要的流行病学意义。 细菌分型的前提是流行病学上相关的菌株源于单一亲代的克隆扩增，分型方法有生物型、药敏 谱型、血清型和噬菌体型等表型方法和质粒分析、染色体DNA限制性内切酶分析、Southern杂交、 PFGE、 PCR分析等基因方法两大类。药敏谱型是细菌耐药性检测方面无可替代，并是医院感染菌株 的流行病学调查的重要内容。 本研究对院内分离的43株菌进行的药敏试验结果显示：大部分菌株呈现多重耐药性。其中 MRSA的菌株对青霉素和头孢唑林的耐药率也较高，达100和92.6，提示该医院分离株对- 内酰 胺类抗生素耐药情况较普遍。对糖肽类抗生素如万古霉素完全敏感，替考拉宁也较敏感，耐药率仅 为3.7。该药敏谱结果与国内其它医院分离株的药敏结果较为相似，但庆大霉素和四环素的耐药率 较其它报道略高5, 6。临床上治疗金黄色葡萄球菌引起的感染应严格根据药敏鉴定结果，明确是否 为MRSA感染。对于MRSA菌株的治疗，仍以糖肽类抗生素为主，应合理规范使用抗生素，以免细菌 耐药性的进一步加重。 2 14 3 9 6 13 12 10 1 15 1 8 18 20 7 23 2 17 24 19 4 16 5 21 0.020.14 图 1 mecA 阳性的 24 株菌的系统进化树分析结果（数字为菌株编号） 现代分子微生物学的研究证实，MRSA耐药的主要机制是由于获得编码低亲和力的青霉素结合 蛋白2a(PBP2a)的mecA基因，从而表现对甲氧西林耐药。MecA 基因位于SCCmec 上，SCCmec主要由 mec基因复合体和ccr基因复合体组成，根据两种基因复合体组成的不同，SCCmec 可以分成5种不同 的基因型别，是一种对MRSA进行分型的重要方法。本研究用PCR法扩增SCCmec 基因分型的特征性 基因，结果显示本医院院内感染菌株以III型为主，其次是II型，未见I型和IV 型菌株。研究发现，来 自不同地区的MRSA菌株流行的基因型别也不相同。有研究对来源于20个国家的304株MRSA菌株进 行SCCmec分型，显示以I型和型为主7 ；另有研究加拿大院内感染分离MRSA菌株主要为 SCCmec11型菌株8 。一般认为，SCCmec I 型为早期医院感染的 MRSA菌株，SCCmec II和型为目 前医院感染的MRSA流行株，SCCmecIV型为社区感染MRSA菌株。本研究结果符合目前医院感染的 流行菌株，提示可能存在院内感染。型菌株SCCmec基因盒存在携带氨基糖苷类耐药基因的 PUB110质粒和携带红霉素耐药基因的Tn554转座子，型菌株具有携带四环素耐药基因的PT181质 粒和Tn554转座子，故型和型菌株一般表现为多重耐药。 整合药敏谱和基因分型结果，分析菌株之间的亲缘关系，结果发现了亲缘关系相近的菌株，提 示这些菌株来源可能相同，具有追溯传染源的意义。此外，这些菌株可能存在小范围的爆发流行， 因此应对这些耐药菌株采取及时而合理的控制。 综上所述，该医院分离出的MRSA菌株存在多重耐药和小规模爆发流行的现状，给临床治疗带 来了一定困难。但菌株对糖肽类抗生素仍较为敏感，本结果有助于临床合理使用抗菌药物。为预防 耐药金葡菌特别是MRSA的产生和传播，院内MRSA 感染患者应注意隔离，防止交叉感染；强调消毒 隔离制度、无菌技术的规范操作，尽量减少侵入性操作；加强综合治疗和护理质量。 参考文献 1. Ito, T., et al., Structural comparison of three types of staphylococcal cassette chromosome mec integrated in the chromosome in methicillin-resistant Staphylococcus aureusJ. Antimicrob Agents Chemother, 2001, 45(5): 1323-36. 2. Ma, X.X., et al., Novel type of staphylococcal cassette chromosome mec identified in community- acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus strainsJ. Antimicrob Agents Chemother, 2002, 46(4): 1147-52. 3. Ito, T., et al., Novel type V staphylococcal cassette chromosome mec driven by a novel cassette chromosome recombi