人参皂甙单体rh_2对人脑胶质瘤细胞u251增殖和凋亡的影响及其机制探讨

人参皂甙单体 R h 2 对人脑胶质瘤细胞 U251 增殖和凋亡的影响及其机制探讨 张继全 ,邱建武 3 ,关 宁 ,张晓健 (辽 宁 医 学 院 ,辽宁锦州 121001) 摘要 :目的 观察人参皂甙单体 Rh2 ( GS2Rh2 )对人脑胶质瘤 U251 细胞增殖和凋亡的影响 ,并 探 讨 其 机 制 。 方 法 用 GS2Rh2 处 理 人 脑 胶 质 瘤 U251 细 胞 ,采 用 MTT 法 检 测 U251 细 胞 增 殖 抑 制 率 ,流 式 细 胞 仪 和 Annexin V 2 F ITC / P I 双 染 法 观 察 U251 细胞凋亡情况 , TRAP2EL ISA 法检测 U251 细胞端粒酶活性 , RT2PCR 法检测 U251 细 胞 人 端粒酶逆转录酶 ( hTERT) mRNA 的表达 。 结 果 5、 10、 20、 40、 80 g/m l GS2Rh2 组 U251 细 胞 增 殖 抑 制 率 分 别 为 20. 42%、 32. 19%、 45. 09%、 57. 37%、 73. 82%。 根 据 细 胞 增 殖 抑 制 曲 线 计 算 出 IC30 、 IC50 、 IC70值 分 别 为 9. 7、 25. 2、 68. 4 g/m l。 F ITC 和 P I 荧 光 双 参 数 点 图 显 示 实 验 组 细 胞 分 布 区 域 与 对 照 组 相 比 出 现 明 显 改 变 ,随 着 药 物 浓 度 的 增加 ,早期凋亡 、 晚 期 凋 亡 或 坏 死 的 区 域 细 胞 数 量 逐 渐 增 多 。 9. 7、 25. 2、 68. 4 g/m l GS2Rh2 处 理 12、 24、 48、 72 h 后 U251 细胞端粒酶活性随 GS2Rh2 浓度增加和作用时间的延长而降低 。 浓 度 为 25. 2 g/m l GS2Rh2 作用 24、 48、 72 h 的 U251 细 胞 hTERT mRNA 与 2actin 灰 度 值 比 为 0. 964 9 0. 004 2、 0. 401 8 0. 001 4、 0. 297 8 0. 001 8,对 照 组 为 0. 976 4 0. 005 1。 作 用 48、 72 h U251 细 胞 hTERT mRNA 与 2actin 灰 度 值 比 与 对 照 组 相 比 P 均 0. 05;作 用 48、 72 h 者相比 P 0. 05。 结 论 GS2Rh2 能够诱导人脑胶质瘤 U25 l 细胞凋亡 ,抑制 U25 l 细胞增殖 。 其 机 制 与 其 抑 制 hTERT 基因表达 ,降低端粒酶活性有关 。 关键词 :人参皂甙单体 Rh2 ;胶质瘤 ;细胞增殖 ;细胞凋亡 ;端粒酶 ;人端粒酶逆转录酶 中图分类号 : R 739. 41 文献标志码 : A 文章编号 : 1 0022266X ( 2010) 2220016203 Effe c t and m echan ism o f g in seno s ide 2R h2 o n hum an g liom a U 251 ce ll p ro life ra tio n a nd apop to s is ZHANG J i2quan, Q IU J ian 2w u, GUAN N ing, ZHANG X iao2jian (L iaoning M edical University, J inzhou 121001, P. R. China) Abstract: O bjective To observe the effect and mechanism of ginsenoside2Rh2 ( GS2Rh2 ) on hum an gliom a U251 cell p roliferation and apop tosis. M ethods Hum an gliom a U251 cells were treated with GS2Rh2 , the inhibitory effect was exam2 ined with MTT. Staining with Annexin V 2F ITC / P I and flow cytometry analysis were used to detect the apop totic cells. TRAP2EL ISA was used to detected telom erase activity and RT2PCR was used to detect the exp ression of hTERT gene. Re2 sults The apop to tic rate was 20. 42% in the group with 5 g/m l GS2Rh2 , 32. 19% in the group with 10 g/m l GS2Rh2 , 45. 09% in the group with 20 g/m l GS2Rh2, 57. 37% in the group with 40 g/m l GS2Rh2, 73. 82% in the group with 80 g/m l GS2Rh2. The value of IC30 , IC50 , IC70 were 9. 7, 25. 2, 68. 4 g/m l respectively. F ITC and P I fluorescence dual2pa2 ram eter point map showed that there was a significantly change between the regional distribution of experim ental cells com2 pared with contro l group , and early apop tosis, late apop tosis or necrosis of regional cells gradually increased with the in2 crease of drug concentration. The telomerase activity of U251 cells which treated with 9. 7, 25. 2, 68. 4 g/m l GS2Rh2 de2 creased with the concentration of GS2Rh2 and the treatm ent tim e. The grey ratio of hTERT mRNA and 2actin in U251 cells treated with 25. 2 g/m l GS2Rh2 fo r 24, 48, 72 h were 0. 964 9 0. 004 2, 0. 401 8 0. 001 4, 0. 297 8 0. 001 8 respec2 tively, and it was 0. 976 4 0. 005 1 in control group. Conclusion s GS2Rh2 can induce hum an glioma U251 cell apop to2 sis, inhibite cell p roliferation. It may be related to GS2Rh2 decreasing hTERT gene exp ression and inhibiting telomerase ac2 tivity. Key words: ginsenoside2Rh2 ; gliom a; p roliferation ; apop to sis; telom erase; human telom erase reverse transcrip tase 文献报道人参皂甙单体 Rh 2 ( GS2Rh2 )具有较强 基金项目 :辽宁省教育厅科研基金资助项目 ( 2009A448) 。 3 通讯作者 的抗肿瘤生物活性 ,对 卵 巢 癌 、 黑 色 素 瘤 、 神 经 胶 质 瘤 、 白 血 病 以 及 人 肺 腺 癌 等 肿 瘤 细 胞 的 增 殖 具 有 明 显的抑制作用 14 。 国 外 研 究 表 明 ,这 种 抗 肿 瘤 用 与 其 诱 导 肿 瘤 细 胞 凋 亡 有 关 5 。 国 内 相 关 报 道 EL ISA 法 。 收 集 药 物 浓 度 为 IC30、 IC50 、 IC70作 用 12、 较 少 。 2009 年 3 7 月 ,我 们 检 测 了 GS2Rh2 对 胶 质 瘤 U251 细 胞 增 殖 和 凋 亡 及 端 粒 酶 活 性 、 人 端 粒 酶 逆转录酶 ( hTERT) mRNA 表 达 的 影 响 。 现 报 告 如 下 。 1 材料与方法 1. 1 材 料 人 脑 胶 质 瘤 U251 细 胞 株 , GS2 Rh2 DM EM 培 养 基 ,胎 牛 血 清 , MTT、 DM SO、 RT2PCR 试 剂 盒 , Annexin V 2F ITC / P I 双 染 试 剂 盒 , TRA P2 EL ISA 试 剂 盒 ,多 功 能 电 泳 仪 , PCR 仪 , B io rad 凝 胶 成像系统 ,流 式 细 胞 仪 。 1. 2 方法 1. 2. 1 U251 细 胞 增 殖 抑 制 率 的 测 算 采 用 MTT 法 。取对数生长期 U251 细 胞 接 种 于 96 孔 培 养 板 (1 104 /孔 ) 。 加 入 终 浓 度 分 别 为 0 (对 照 组 ) 、 5、 10、 20、 40、 80 g/m l 的 GS2Rh2 , 每 孔 设 4 个 复 孔 。 37 、 5% CO2 孵箱中培养 48 h。 每 孔 加 入 5 mg/m l MTT 溶液 20 l,继续培养 4 h 后加入 DM SO 150 l, 24、 48、 72 h 的 实 验 组 和 对 照 组 U251 细 胞 ,分 别 加 入 200 l 细 胞 裂 解 液 ,取 上 清 液 并 根 据 试 剂 盒 提 供 的引物和预设 PCR 程序进行端粒序列扩增 ,将 扩 增 产物顺序进行杂交 、 显 色 处 理 后 室 温 放 置 20 m in,最 后加入 100 l 反应终止液 ,制 备 的 样 本 用 酶 联 免 疫 检 测 仪 分 别 测 450 nm 和 690 nm 波 长 的 OD 值 ,两 者 差 值 代 表 细 胞 端 粒 酶 活 性 。 以 U251 细 胞 提 取 液 于 65 加 热 10 m in 后 为 阴 性 对 照 ,以 人 胚 肾 293 细胞株端粒酶提取液为阳性对照。 1. 2. 4 U251 细 胞 hTERT mRNA 的检测 采用 RT2 PCR 法 。 分 别 取 对 照 组 和 浓 度 为 IC50 GS2Rh2 作 用 24、 48、 72 h 的 实 验 组 U251 细 胞 ,提 取 各 组 细 胞 总 RNA,逆 转 录 制 备 cDNA , 然 后 进 行 聚 合 酶 链 反 应 ( PCR) 。 操 作 按 试 剂 盒 说 明 书 进 行 。 利 用 图 像 分 析 软件 Gene Too ls 分析各组 hTERT、 2actin 两 条 基 因 条带的灰度比 。 1. 2. 5 统 计 学 方 法 采 用 SPSS 13. 0 统 计 软 件 。 酶联免疫检测仪 570 nm 波 长 处 测 定 吸 收 度 OD 值 。 数据用 x s 表 示 。 两 样 本 均 数 比 较 采 用 配 对 t 检 细 胞 增 殖 抑 制 率 = ( 1 - 加 药 组 OD 值 /对照组 OD 值 ) 100%。绘制细胞增殖抑制曲线图 ,横 坐 标 为 GS2Rh2 浓度 ,纵 坐 标 为 细 胞 抑 制 率 ,计 算 IC30 、 IC50 、 IC70 。 1. 2. 2 U251 细 胞 凋 亡 情 况 的 观 察 采 用 Annexin V 2F ITC / P I 双 染 法 和 流 式 细 胞 术 。 收 集 浓 度 为 IC30 、 IC50 、 IC70 的 GS2Rh2 作 用 48 h 的 实 验 组 和 对 照 组 U251 细 胞 。 调 待 测 细 胞 浓 度 为 1 106 /m l。 取 1 m l 细胞 , 1 000 r/m in, 4 离 心 10 m in,弃上清 ,再加入 1 m l 的 冷 PB S 同法离心 ,弃上清 ,将细胞重悬于 200 l B inding Buffer 中 ,加入 10 l Annexin 2F ITC 和 5 l P I,轻 轻 混 匀 后 避 光 4 反 应 30 m in;最 后加入 300 l B inding Buffer 用流式细胞仪观察细胞凋亡情 况 。 1. 2. 3 U251 细 胞 端 粒 酶 活 性 的 检 测 采用 TRA P2 验 。 P 0. 05 为 差 异 有 统 计 学 意 义 。 2 结果 2. 1 U251 细胞增殖抑制率 5、 10、 20、 40、 80 g/m l GS2Rh2 组 U251 细 胞 增 殖 抑 制 率 分 别 为 20. 42%、 32. 19%、 45. 09%、 57. 37%、 73. 82%。 根 据 细 胞 增 殖 抑制曲线计算出 I C30 、 IC50 、 IC70值 分 别 为 9. 7、 25. 2、 68. 4 g/m l。 2. 2 U251 细 胞 凋 亡 情 况 F ITC 和 P I 荧 光 双 参 数 点 图 显 示 对 照 组 细 胞 主 要 分 布 在 左 下 象 限 的 活 细 胞 区 ,实验组细胞分布区域出现明显改变 ,随着药物浓 度的增加 ,早期凋亡 、 晚 期 凋 亡 或 坏 死 的 区 域 细 胞 数 量逐渐增多 。 2. 3 U251 细 胞 端 粒 酶 活 性 对 照 组 和 9. 7、 25. 2、 68. 4 g/m l GS2Rh2 组 U 251 细 胞 培 养 0、 12、 24、 48、 72 h 端粒酶活性见表 1。 表 1 对照组和 GS2Rh2 组 U251 细胞培养不同时间端粒酶活性比较 ( -x s) 端粒酶活性 (OD 值 )组别 培养 0 h 培养 12 h 培养 24 h 培养 48 h 培养 72 h 对照组 1. 713 4 0. 010 4 1. 716 5 0. 016 8 1. 705 7 0. 013 2 1. 705 6 0. 108 3 1. 709 1 0. 012 3 9. 7 g/m l GS2Rh2 组 1. 701 9 0. 011 2 1. 709 3 0. 143 6 1. 697 1 0. 011 3 1. 594 8 0. 013 13 0. 926 3 0. 096 93 25. 2 g/m l GS2Rh2 组 1. 713 1 0. 009 7 1. 707 2 0. 143 2 1. 599 1 0. 012 43 1. 207 2 0. 014 93 0. 793 4 0. 012 93 68. 4 g/m l GS2Rh2 组 1. 710 3 0. 013 1 1. 674 1 0. 032 43 1. 414 1 0. 012 93 0. 989 0 0. 112 73 0. 615 5 0. 025 83 注 :与对照组相比 , 3 P 0. 05 2. 4 U251 细 胞 hTERT mRNA 浓度为 25. 2 g/m l GS2Rh2 作用 24、 48、 72 h 的 U251 细 胞 hTERT mR2 NA 与 2actin 灰 度 值 比 为 0. 964 9 0. 004 2、 0. 401 8 0. 001 4、 0. 297 8 0. 001 8, 对 照 组 为 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 0. 976 4 0. 005 1。 作 用 48、 72 h U251 细 胞 hTERT mRNA 与 2actin 灰 度 值 比 与 对 照 组 相 比 P 均 0. 05;作 用 48、 72 h 者相比 P 0 . 05。 3 讨论 2 人 参 为 五 加 科 多 年 生 草 本 植 物 ,是 有 着 近 几 千 年 应 用 历 史 的 名 贵 中 药 。 GS2Rh2 是 从 人 参 中 分 离 得到的原人参二醇型低糖链皂苷单体 。 大 量 研 究 表 明 , GS2Rh2 在 肿 瘤 的 预 防 和 治 疗 方 面 具 有 较 强 的 活 性 , GS2Rh2 的 抗 肿 瘤 作 用 较 为 广 泛 ,既 可 阻 滞 细 胞 周期 ,诱 导 癌 细 胞 凋 亡 和 抑 制 肿 瘤 的 生 长 或 诱 导 细 胞分化使其逆转 ,抑制肿瘤的转移 ,影响和调节免疫 功能 ,增强机体对疾病的抵抗能力 ,从而抑制肿瘤的 生长 ,还可增强抗癌药的药效 1 。 GS2Rh 抗 肿 瘤 作 用具有多靶点 、 多 效 应 的 特 点 ,同 时 其 不 良 反 应 少 , 不易产生耐药性 ,是近年来研究的热点 。 肿 瘤 主 要 发 生 机 制 之 一 是 细 胞 正 常 的 有 限 生 命 周期缺陷 ,使 细 胞 永 生 化 。 端 粒 酶 的 激 活 是 细 胞 永 生 化 的 关 键 步 骤 2 。 无 限 增 殖 和 凋 亡 抑 制 是 肿 瘤 细胞共有的特征 ,由 此 引 起 的 细 胞 异 常 蓄 积 是 肿 瘤 发生 、 发 展 的 中 心 环 节 3 。 Kyo 等 4 研 究 表 明 hTERT 是端粒酶活性的限制性成分 , hTERT 的表 达 与端粒酶激活和肿瘤发展存在着密切关系 。 本 研 究 结果显示 ,在 体 外 GS2Rh2 对 人 脑 胶 质 瘤 U251 细 胞 增 殖 有 明 显 抑 制 作 用 , IC50为 25. 2 g/m l。 通 过 流 式 细 胞 仪 检 测 细 胞 凋 亡 的 荧 光 双 参 数 点 图 发 现 ,各 实 验 组 细 胞 分 布 区 域 发 生 了 明 显 变 化 ,并 且 随 着 药 物 浓 度 增 加 活 细 胞 的 分 布 区 域 细 胞 数 量 逐 渐 减 少 , 而凋亡早期 、 凋 亡 晚 期 或 坏 死 区 细 胞 数 量 相 应 增 多 。 表明 GS2Rh2 能 够 抑 制 人 脑 胶 质 瘤 U25 l 细 胞 增 殖 , 诱导 U25 l 细胞大量凋亡 ,且凋亡早期细胞数量尤 为 明 显 。 端 粒 酶 的 活 性 表 现 是 人 端 粒 酶 逆 转 录 酶 ( hTERT)以 人 端 粒 酶 RNA ( hTR )为 底 物 合 成 端 粒 序列维持端粒在一定长度 ,稳定染色体结构 ,使细胞 成 为 永 生 性 细 胞 5 。 hTERT 是 端 粒 酶 活 性 的 限 速 因素 , 在 端 粒 酶 阳 性 的 肿 瘤 中 常 见 hTERT 高 表 达 6 。 hTERT 基 因 表 达 可 以 反 映 端 粒 酶 活 性 与 hTERT mRNA 水平 ,端 粒 酶 激 活 与 凋 亡 调 控 失 控 同 为 肿 瘤 恶 性 转 化 的 早 期 事 件 7 。 本 研 究 结 果 显 示 , GS2Rh2 可以抑制细胞的端粒酶活性变化 ,实 验 组 随 着 时 间 延 长 和 剂 量 加 大 端 粒 酶 活 性 逐 渐 降 低 ,并 呈 现时间和剂量依赖性关系 ,通 过 药 物 抑 制 端 粒 酶 催 化 亚单位 hTERT 的 表 达 ,可 降 低 端 粒 酶 活 性 ,最 终 导 致 肿 瘤 细 胞 死 亡 , 从 而 达 到 治 疗 肿 瘤 的 目 的 。 hTERT mRNA 水 平 与 端 粒 酶 活 性 密 切 相 关 , hTERT 的激活对肿瘤细胞中端粒酶活性的激活是必需和足 够的 , hTERT 的 表 达 是 端 粒 酶 活 化 和 细 胞 癌 变 的 限 速步 骤 8 。本 实 验 通 过 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 获 得 hTERT 基 因 扩 增 条 带 表 明 , GS2Rh2 能 抑 制 hTERT mRNA 的表达水平 ,图 像 分 析 软 件 显 示 实 验 组 与 对 照 组 相 比 较 扩 增 条 带 灰 度 比 有 显 著 性 差 异 ,并 随 着 药 物 作 用 时 间 的 延 长 hTERT mRNA 的 表 达 量 越 来 越少 。 因 此 ,利 用 hTERT 启动子的癌细胞相对特 异 的转录活性 ,可将其作为肿瘤基因治疗靶标 9 。 综上所述 , GS2Rh2 促 进 人 胶 质 瘤 U251 细 胞 凋 亡 , 抑 制 其 增 殖 。其 机 制 可 能 与 GS2Rh2 抑 制 hTERT 基因表达 ,降低端粒酶活性有关 。 参考文献 : 1 张丽媛 ,吴 铁 . 人 参 皂 苷 Rh2 抗 肿 瘤 作 用 机 制 的 研 究 进 展 J . 安徽农业科学 , 2008, 36 ( 4) : 146721468, 1483. 2 Dunn IF, B lack PM. The neuro s