乙酰胆碱酯酶基因工程技术研究进展

乙酰胆碱酯酶基因工程技术研究进展 摘要：乙酰胆碱酯酶(AChE)是一种催化乙酰胆碱分解的水解酶。它与有机磷农药有特 异反应。利用AChE基因工程技术进行有机磷农药的快速检测、人类疾病防治、生态环境保 护和昆虫的抗药性等方面的研究具有非常重要的意义。该文综述了当前国内外有关AChE的 基因克隆技术与表达系统的研究进展，并对AChE转基因技术的现状和问题进行了分析讨论。 展望了AChE基因工程技术在农药快速检测、环境保护、人类疾病防治等领域中的应用前景。 关键词：乙酰胆碱酯酶；基因克隆；转基因；有机磷农药 Advances in the Genetic Engineering of Acetylcholinesterase Abstract: Acetylcholinesterase(AChE) was an acetylcholine hydrolase which had a high Insensitivity and a better close-effect relationship to organophosphate AChE genetic engineering played an important role in organophosphate pesticideResidue fast detection technology and expression system of AChE were reviewed In the paper ,in the meantime ,the status que and problems about transgenic Technology of AChE also were disscussed in detail, At last perspectives Of AChE genetic engineering were pointed out Keyword : AChE, gene cloning, transgenic technology ,organophosphorus pesticides 乙酰胆碱酯酶(AChE，Ec 3117)是一种催化乙酰胆碱分解的水解酶，具有能被有 机磷和氨基甲酸酯类农药强烈抑制的特此，可根据AChE的活性变化来监测农产品或环境中 有机磷和氨基甲酸酯类农药的残留量。目前，人们已通过基因片段克隆、x一衍射技术以及 原子力学显微等技术，对AChE的分子形式、氨基酸结构、AChE的抗性和晶体结构 等方面 进行了探索研究，在AChE的三维结构、AChE的位点特异性突变分析以及AChE在细胞凋亡过 程中的作用机制 等方面取得了一定进展。 但是，由于当前AChE的研究重点主要集中在生化毒理学、神经生物学和药理学方面， 确切地说，主要集中在昆虫抗药性、人类疾病防治等研究领域，而在环境保护方面却很少 涉及，目前有关AChE在环境保护领域中的研究主要集中在农药残留检测传感器的研制上， 但是效果不是很理想，因为传感器的精确度、灵敏度的高低取决于选用的乙酰胆碱酯酶酶 源对农药的敏感性。因此，如果要想AChE在环保方面发挥更大的作用，就必须深入开展 AChE的基因克隆技术及转基因技术的研究，运用这些技术来获得足够的高灵敏度优质酶源。 当前有关AChE的基因克隆技术及其转基因技术应用于环境保护的报导甚少，为了引起人们 对AchE的广泛关注，使其在农药残留监测、生态环境保护领域中发挥更大的作用。本文就 近年有关AChE基因工程技术的应用研究迸展、存在问题以及前景展望作一综述. 1、 AChE基因结构和克隆技术 11 AChE基因结构、 从目前已克隆的AChE基因来看，绝大部分生物的AChE均由单个Ace基编码。但也有特殊 的情况出现如线虫饧m砷撇蚴基因组中发现了四种A(Acel，A一2，Ace一3，Ace一4) 基因。在棉蚜桃蚜、冈比亚按蚊和三带喙库蚊等四种昆虫中也发现2种Ace(A一1，Ace一2)基 因，它们编码的AChE对抑制剂的敏感性不同，对底物的催化性质也存在着差别。但是，这 些基因的存在并没有影响拥有多个Ace基因编码的生物生长和繁殖 。此外，在不同生物 种类间，因Ace的碱基长度、内含子、外显子的数目不同而Ace 结构也不同。 AChE的催化亚基是由单个基因编码的，亚基类型有AChE(S)、AChE(H)和AChE(T)三种， 每个催化亚基可由单聚体(G1)、二聚体(c2)和四聚体(G4)组成。这些催化亚基的类型是由 编码AChE羧基端的C一末端肽决定。因C一末端肽的不稳定性。从而影响催化亚基复制结果， 造成了基因产物的多型性。 AchE基因组DNA的功能研究表明 ，DNA的外显子3H与外显子l和2直接连接，构建了质 粒转染的GOS一7细胞，并在细胞膜表面表达AChE；用磷脂酰肌醇特异性磷酸酯酶C处理后。 活性的Ac托从细胞膜上解离，释放人介质中。如果构建缺少3H的编码AChE的cDNA质粒转 染则会产生分泌型蛋白质。因此，3H编码的顺序对翻译后修饰，包括对羧基末端的切割 和糖磷脂的加入，是必需的并且要足够。根据目前对外显子的研究可知 ，AChE的催化亚 基的异质、不对称和连脂形式以及同质可溶性AChE的催化亚基均由外显子I、2和3A编码， 而含糖磷脂的催化亚基由外显子1、2和3H编码，因翻译后修饰的结果而造成产物型的多样 化。 12 AChE基因克隆技术 目前人们已经在马铃薯叶甲、黑尾叶蝉、埃及伊蚊、麦蚜等多种昆虫以及电鳐等生功 地克隆了AChE基因，采用的技术主要有聚合酶链式反应(PcR)、反转录一聚合酶链式反应 (RTPCR)技术以及定点突变技术。这几种基因克隆技术的原理及其应用情况分述如下。 121聚合酶链式反应(PCR) 该方法是首先提取染色体DNA或RNA，然后以染色体DNA或第l链cDNA为范本，以人工合 成的一对寡核苷酸为引物，在有dNIP存在的条件下，通过DNA模板的变性、模板与引物的退 火及引物的延伸3个阶段的多次循环来扩增目的基因。PcR产物经纯化后克隆至合适的质粒 载体上，用酶切分析和序列测定鉴定所得的重组子。张玲敏和吴明玮 就是通过该方法获 得了白纹伊蚊AChE基因片段的PcR扩增产物。 122反转录一聚合酶链式反应(RTPcR) 、 RTPcR是从生物组织或细胞中提取纯化的总RNA，在Oligo(dT)引导和反转录酶的作用 下以总RNA中的n，删A为范本，合成总的cDNA的第一链。然后，以两个引物所结合的单链 cDNA为模板，在Tap聚合酶的作用下进行PcR扩增，最后合成双链目的cDNA,例如Sussman.J K等人对电鳐Torped californica中的AChE的cDNA克隆；杨之帆和何光存 对褐飞虱的 AChE基因cDNA片段的克隆均获得成功。当前，RT一PcR技术多被应用于寻找和分析由AChE的 基因变构而引起害虫抗性增强的原因。 123定点突变技术、 定点突变技术是在待突变位点设计突变引物(两引物5端相邻)，直接以双链DNA为模 板，以突变引物进行PcR。采用DNA聚合酶扩增，得到含平末端的PcR产物，产物纯化后对末 端进行磷酸化处理，在DNA连接酶的作用下连接处理后的PcR产物，得到含目的片段的环状 双链DNA转化入相应的宿主菌(如大肠杆菌、枯草杆菌等)，对转化子鉴定，得到目的DNA。 例如，施明安 通过定点突变技术对家蝇AChE突变点进行克隆，获得了家蝇野生型的三种 突变型 AchE(D421V,V260L/G342A/F407Y,V260L/G342A/F407Y/D421V)的AChE基因片段。该 项技术多用于已知突变型AChE的克隆研究。 2、 AChE的基因表达系统 基因表达技术是基因工程技术的核心内容。人们把克隆出的AChE基因，通过外源基因 表达系统获得了理想的结果。当前，常用于表达AChE基因的基因表达系统有大肠杆菌表达 系统、酵母表达系统及杆状病毒表达系统。 21大肠杆茵表达系统 该系统是基因表达技术中发展最早、使用最广泛的经典表达系统。它具有遗传背景清楚目 标基因表达水平高、抗污染能力强、培养方法简单、生长迅速、成本低的特点。如李阳芳 等 将克隆到的人源AchE的cDNA在大肠杆菌中表达，获得的产物纯度达到90以上。尚金 燕 通过该系统获得了家蚕的乙酰胆碱酯酶。但是由于大肠杆菌表达系统为原核表达系统， 表达的真核基因必须是mRNA的转录产物cDNA，不能表达基因组DNA。使用受到一定的限制。 此外，在利用该系统培养所需的蛋白过程中，会产生难以消除的内毒素，影响了产品的纯 度。这样在一定程度上限制了AchE的大量表达。 22酵母表达系统 该系统为真核表达系统，具有繁殖迅速、营养要求简单和便于工业化大规模发酵生产 的优点。此外，它克服了大肠杆菌表达系统的缺点，不产生毒素，安全可靠；具有分泌功 能，使蛋白分泌到胞外。利于纯化；可对蛋白进行多种翻译后的修饰，利于保持生物产品 的活性和稳定性。例如，Mendslson 等 利用该系统大量表达了电鳐的AChE，Ovadia lazari等 利用该表达系统获得了肺蠕虫的两种可溶性脚。徐瑶 则获得了果蝇乙酰胆 碱酯酶基因的分泌表达。 23杆状病毒表达系统 与以上两个表达系统相比，杆状病毒表达系统具有：(1)允许插入较大的外源基因，采 用双启动子则可以同时表达两种外源基因。(2)能较高水平表达不同生物来源的基因，既可 实现胞内表达，也可进行分泌性表达。(3)有效进行蛋白翻译的加工，具有转运糖基化、磷 酸化、脂肪酶化、酰胺化、切割信号肽和形成三级或四级高级结构的特点。(4)使用安全。 因为它具有严格的宿主细胞专一性，不会在非宿主细胞中繁殖或发生整合。例如，南京农 业大学的董双林和韩召军 利用该系统在昆虫Sf9细胞系中成功并大量地表达了棉蚜的 AchE，李春晓等 也通过同样的方法成功表达了有活性的淡色库蚊的AChE。在AchE基因表 达系统的研究中，除了上述3个常用的表达系统外，还在HEK293细胞，C0s细胞，及CH0细胞 等真核表达体系中成功表达AChE。这些工作为探索大量表达AChE基因提供了有价值的参 考。但是由于目前产量还不高，只能满足于实验上的研究需要。要想大规模实际应用，还 需要进一步完善各个系统，甚至开发专一表达AChE基因的系统。 3、 AChE的转基因技术现状和存在问题 当前，转基因的动植物、食品逐渐走进人们的生活视野：如有色棉花、保鲜西红柿、 抗病毒甜椒、含生长激素的牛奶等。因此，从理论上说，可通过转基因技术从动物的或植 物中获取大量所需的AChE基因。目前人的AchE基因已经在西红柿和大鼠上获得了成功，但 是有关AChE的转基因植物和转基因动物例子还是很少的。这当中既有基因工程技术的原因， 也有社会对转基因生物认可程度的影响。主要存在以下几方面问题： 31 AChE基因克隆和转基因技术问题 311AchE是神经元突触部位释放的功能蛋白质，含量非常少，体内翻译它的mRNA也 相对较少，克隆表达水平比较低。 312细胞表达AChE的量有一个限度。Zhang XJ等 在研究AChE与细胞凋亡的关系 时发现，AChE的过量表达可以提高细胞对凋亡的敏感性。这不但限制了AchE的大量表达， 而且还影响了转化体的存活。 313导人基因诱导启动正常状态下处于关闭状态的基因，给生物的安全埋下了隐患。 Susana Constantino Rosa Santos等 在通过内皮细胞内表达需要的分子量为70kDa的 AChE时，发现产物中还含有分子量为55kDa的AChE，而该非目的产物在内皮细胞里原本是不 存在的，这一现象说明导人的基因启动了某个表达55kDa的AChE基因。这不但影响目的蛋白 纯度，还会影响遗传的稳定性。 31，4 AchE基因在转化体中的表达难以控制。宿主细胞在表达前会对要表达的基因 片段进行有利于自身表达的调整，经常会出现异位表达和个体发育不适宜的阶段表达，影 响基 因表达能力或基因表达的组织特异性，从而使大部分的基因表达水平偏低和少部分基因表 达水平偏高，影响了目的基因的表达量。例如，Samuel P等 在利用西红柿表达人的 AChE基因时，发现转导的西红柿根、茎、叶的AChE含量与未转导的存在显著差异，有的增 多，有的减少，使植株的生理特性发生变化，导致存活期短。 32转基因生物的社会影响 321转基因生物的生物安全问题。从理论上说，基因工程处理可以将外源基因准确 插入所需的特异位点上，但实际上无法精确做到。即使插入了。也常常插不到不被破坏的 合适位置。因此，转基因生物的构建过中必定存在大量的随机成分，出现生物性状的随机 可变性，导致产生不可预测的副作用。此外，所需表达的外源性基因并不是基因构建物中 的唯一导入基因，随它一起导入的还有一个启动功能的病毒启动子基因以及表征是否转基 因成功的抗生素标记基因，启动子的性质导致了插入基因的不稳定性存在。因此，从总体 上分析，转基因生物一般都是不稳定的外源基因的功能会发生变化，这是引起转基因生 物安全性问题的根源所在 (21)。 322转基因生物的检验措施和检验技术水准落后.转基因产品与非转基因产品从物 理外观上无法区分，因此，检验就必须通过较复杂的化学手段。但是因为基因数量太大了， 而且应用范围广泛，无论程序的开发，还是检验本身，成本都很高；且化学检验越复杂， 所需的检验时间就越长。以上两方面束缚了AChE基因工程技术的发展，要解决好这些问题， 必须在转基因技术上寻找突破口，解决转基因生物的基因调控表达和稳定遗传问题。虽然 基因剔除(Gene knock out)、基因打靶(Gene targeting)和酵母人工染色体 (YeastAetificial Chromosome)等技术已经被运用到转基因研究上，但是这些技术尚未 发展成熟，运用不广泛，还需借助新理论、新技术的创立以及相关学科的发展。目前研究 者在基因调控表达和稳定遗传方面已取得了一定的成果。例如，George J Murphy等 (22) 通过对哺乳动物细胞中基因表达外因控制的研究，发现把一种单一的终止密码子序列导入 外源基因内，能有效地调控基因表达。该项研究成果为我们解决转基因表达控制问题奠定 了基础。此外，Brian D Brown等(23)通过对带菌者造血细胞中micro RNA和target mRNA 的研究中发现：在target mRNA翻译前，micro RNA的含量影响着target mRNA的翻译水平， 使带菌者的造血细胞表达发生改变，但这种改变并没让带菌者产生不适的反应。这个结论 为解决转基因生物的遗传稳定性提供了新思路。 4、前景展望 随着x一衍射技术、原子力学显微技术、基因工程定点突变技术、计算机模拟技术等的 发展。相信在不久的将来，在AChE的结构和功能的研究、AchE的遗传学研究以及不同生物 AChE的分子生物学机制研究等方面必将取德新的成果。当这些成果被运用到环境污染监测、 生态环境保护以及人类疾病治疗等领域时，产生的价值是不可估量的。 在环境污染监测方面。由于各种理论和技术的发展，对研制灵敏、快速、简易的农药 残留检测仪产生了巨大的推动作用。现在，纳米生物传感器的概念已经提出，虽然还处于 起步阶段，但是可以预见它将是未来生物传感器研制的一个发展方向。应用纳米技术固化 和修饰AChE，使其具有优异的检测性能和稳定性。例如，用硅纳米线 (24)把敏感的乙酰胆 碱酯酶包埋起来制成芯片，精确地检测农药残留量。此外，我们还可以利用转基因技术生 产“全天候环境检测预报员”。譬如，克隆含有特性AchE的“变色鱼”。使它根据水体中 农药的含量不同而显示不同的颜色，实时检测水质情况。 在生态环境保护方面。AChE正同样扮演重要的角色。当前防治农作物害虫的方法多是 依赖化学药物，虽然可以杀死目标害虫，但同时也引起害虫产生抗药性或导致有益生物死 亡。这样势必会影响生态系统的平衡，有悖于生态综合治理的理念。因此，须重视昆虫抗 药性机制的研究。其主要途径是研究变构AchE与昆虫抗药性的关系。一方面，可以提高用 药的准确性和精确度，有助于开发环保、高效、不易产生抗性的药剂。另一方面