不同浓度葡萄糖对mg63细胞株trail表达的影响

不同浓度葡萄糖对 MG63细胞株 TRAIL 表达的影响 来源：彩超探头 【摘要】 目的： 观察不同浓度葡萄糖环境下人成骨 肉瘤 MG63细胞株肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）及 其护骨素（OPG）、护骨素配体（OPGL）的表达，探讨糖尿病 骨质疏松症的发病机制. 方法： 用不同浓度葡萄糖(5.5, 16.7, 33.3 mmol/L)分别刺激培养的 MG63细胞24 h， RTPCR 法检测 TRAIL， OPG， OPGL mRNA 的表达，免疫组织化学法 检测 MG63细胞中 TRAIL 的表达及分布. 结果： 葡萄糖对 MG63细胞中 TRAIL， OPGL mRNA 的表达，均按照对照组、5.5 mmol/L 组、16.7 mmol/L 组、33.3 mmol/L 组顺序递增 （P0.05），OPG mRNA 的表达按照此顺序递减（P0.05）. 33.3 mmol/L 组 TRAIL mRNA 的水平明显高于对照组 (1.0040.070) vs (0.7400.023), P0.05, TRAIL 免疫反应阳性物质密度也明显高于对照组. 结论： 高糖环 境可能导致成骨细胞中 TRAIL 和 OPGL 表达增多，OPG 的表达 减少，这可能是糖尿病骨质疏松症的重要发病机制之一. 【关键词】 葡萄糖；MG63细胞；肿瘤坏死因子相关凋亡 诱导配体 0引言 糖尿病易并发骨质疏松症已被公认, 糖尿病对骨代谢的 影响主要表现为骨吸收增加,骨形成减少与缓慢,使骨矿物质含 量减少和骨质疏松1. 确切的细胞机制尚未阐明. 肿瘤坏 死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand, TRAIL）是新发现的肿瘤坏死因 子超家族的成员，可表达于人体的许多组织，对许多肿瘤来源 的细胞具有很强的杀伤作用2-3，可介导病毒引起的凋亡 4-5，并在一些自身免疫疾病中起作用6. 但在糖尿病 骨质疏松发病中是否起作用，目前少见报道. 我们观察不同浓 度葡萄糖环境下具有人成骨细胞表型特征的 MG63细胞株中 TRAIL 及其护骨素（osteoprotegerin, OPG）、护骨素配体 （osteoprotegerin ligand, OPGL）的表达情况, 进一步探讨 糖尿病骨质疏松症的发病机制. 1材料和方法 1.1材料第106代 MG63细胞株由中南大学湘雅二医院代谢 内分泌研究所惠赠；MEM 培养液(Sigma 公司)；胎牛血清(杭州 四季青生物工程材料研究所)；牛血清白蛋白、Trizol 试剂盒 （Gibco 公司）；逆转录反应试剂盒（Promega 公司）；PCR 扩增试剂盒和 DNA 梯度 Marker（TaKaRa 公司）；引物由北京 三博远志公司合成. 鼠抗人 TRAIL mAb（本校免疫学教研室）； 生物素标记的羊抗鼠 IgG 抗体（宝泰克公司）；ABC 复合物 （华美生物工程公司）；DAB（Sigma 公司）. 1.2方法 1.2.1细胞培养将第106代 MG63细胞株以5108/L 密度接 种于培养瓶或制成单细胞悬液接种于预先放置4张7 mm22 mm 盖玻片的培养皿中,用含100 mL/L 胎牛血清、50 mg/L 维生素 C 的无酚红 MEM 培养液,于37 , 50 mL/L CO2条件下培养,2 d 换液1次. 1.2.2干预试验接种于50 mL 细胞培养瓶的 MG63细胞达 60%70% 汇片，行细胞爬片的 MG63细胞贴壁后即分别换含1 g/L 牛血清白蛋白的无血清 MEM 培养液培养3 h,再分别用含不 同浓度葡萄糖的 MEM 培养液干预,分为4组： 培养基对照组； 5.5 mmol/L 组；16.7 mmol/L 组；33.3 mmol/L 组. 干预24 h 后,抽提细胞总 RNA 行 RTPCR 操作及免疫组化检测. 以上各组 实验均独立重复5次. 1.2.3RTPCRTrizol 抽提 MG63细胞总 RNA. 取2 g 总 RNA，用逆转录试剂盒合成 cDNA，再取1 L cDNA 行 PCR 扩 增 OPG， OPGL， TRAIL 基因，以 actin 基因为内对照. OPG 上游引物： 5AGTGGGAGCAGAAGACATTG3，下游引物： 5ATTGGACCTGGTTACCTATC3，扩增长度为268 bp；OPGL 上 游引物： 5GCGTCGCCCTGTTCTTCTAT3，下游引物： 5TTGGTGCTTCCTCCTTTCAT3，扩增长度为598 bp；TRAIL 上 游引物： 5GGCATTCATTCCTGAGCAACTT3，下游引物： 5GATCTCGTGATCTACCCACCTT3，扩增长度为908 bp. 反应体 系为25 L，双蒸水18 L， 10Buffer 2.5 L, Taq 酶 0.5 L，上游引物各2 L，下游引物各2 L，模板1 L. OPG 反应条件：94 预变性3 min，94 变性30 s, 55 退 火15 s, 72 延伸30 s，共30个循环，最后延伸10 min. OPGL 反应条件：94 预变性3 min，94 变性30 s,55 退 火15 s，72 延伸40 s,共30个循环，最后延伸10 min. TRAIL 反应条件：94 预变性3 min，94 变性30 s,57 退火15 s，72 延伸60 s，共30个循环，最后延伸10 min. 分别取10 L PCR 扩增产物于含0.5 mmol/L 溴化乙锭的20 g/L 琼脂糖凝胶电泳并拍照，并用凝胶成像分析系统行条带光 密度定量检测，测值与 actin 光密度值比较，比值表示各指 标的 mRNA 表达量. 1.2.4免疫组化细胞爬片利用 ABC 技术进行免疫组化染色， 按免疫组化 ABC 试剂盒说明书所示步骤染色. 采用 OLYMPUS BH2光学显微镜观察并摄片,以正常羊血清及 PBS 代替一抗染色,作 为阴性和空白对照. 统计学处理： 用 SPSS13.0软件包统计分析. 方差齐性时 数据用 xs 表示，组间比较用单因素方差分析，组间两两比 较用 LSDt 检验，方差不齐时数据用中位数（四分位数间距） M（QR）表示，采用秩和检验，组间两两比较用 Nemenyi 法检验. 2结果 2.1葡萄糖对 MG63细胞 TRAIL 和 OPG mRNA 表达的影响 RTPCR 半定量结果显示,葡萄糖能上调 MG63细胞中 TRAIL mRNA 的表达. 16.7 mmol/L 的葡萄糖即可出现上调作用，并在33.3 mmol/L 时上调作用更明显. 高葡萄糖能下调 MG63细胞中 OPG mRNA 的表达，与对照组和5.5 mmol/L 葡萄糖组相比，16.7 mmol/L 的葡萄糖即可降低 OPG mRNA 表达，并在33.3 mmol/L 时下调作用更明显（表1，图1）. 另一方面，相同浓度的葡萄 糖能上调 MG63细胞中 OPGL mRNA 的表达, 按照对照组、5.5 mmol/L 组, 16.7 mmol/L 组, 33.3 mmol/L 组的顺序，OPGL mRNA 的 A 值的 M（QR）分别为0.107 (0.008), 0.114(0.015), 0.206 (0.040), 0.234 (0.037),经检验，33.3 mmol/L 组的 OPGL mRNA 表达明显高于对照组（P0.05，图1). 表1不同浓度葡萄糖对 MG63细胞 TRAIL，OPG 及 OPGL mRNA 表达的影响（略） aP0.05 vs 对照； cP0.05 vs 5.5 mmol/L； eP0.05 vs 16.7 mmol/L. 2.2葡萄糖对 MG63细胞 TRAIL 免疫组织化学染色的影响 TRAIL 免疫反应阳性细胞多数呈梭形，少数呈不规则形. 阳性 物质呈棕黄色颗粒,位于胞质内，胞核阴性. 在培养基对照组 及5.5 mmol/L 组中，TRAIL 免疫反应产物呈阴性或弱阳性. 在高浓度葡萄糖组中，TRAIL 免疫反应阳性物质密度明显增高 （图2）. 1： 对照组；2： 5.5 mmol/L 组；3：16.7 mmol/L 组； 4：33.3 mmol/L 组. 图1不同浓度葡萄糖对 MG63细胞 TRAIL，OPG 及 OPGLmRNA 表达的影响（略） A： 对照组；B： 5.5 mmol/L 组；C： 16.7 mmol/L 组； D： 33.3 mmol/L 组. 图2不同浓度葡萄糖对 MG63细胞 TRAIL 免疫反应产物的 影响 SABC 200（略） 3讨论 糖尿病易并发骨质疏松症已被公认,且动物实验表明在糖 尿病大鼠病程早期即表现为成骨细胞数下降、破骨细胞数上升， 说明骨形成减少，骨吸收相对大于骨形成7. 但其确切的 细胞机制尚未阐明. TRAIL 是新发现的肿瘤坏死因子超家族的凋亡分子，可能 与多种受体结合，发挥诱导或抗凋亡作用. TRAIL 有5个受体： 死亡受体（DR4， DR5）、诱骗受体（DcR1， DcR2）和分泌型 受体 OPG. TRAIL 与 DR4,DR5相互作用，诱导许多组织来源的 肿瘤细胞株迅速凋亡，但不能诱导正常细胞凋亡. TRAIL 的两 个诱骗受体 DcR1缺乏死亡功能区，DcR2只含有死亡功能区的 1/3，因而不能介导凋亡，但是可以抑制 DR4,DR5介导的凋亡 8. OPG 是一个分泌型的 TNF 受体，是骨代谢的一个重要 的负调控因子，能抑制破骨细胞生成、活化,减少骨吸收9- 11， 增加骨密度的作用. 它主要通过中和性结合 OPGL 发挥 骨保护作用,后者是诱导破骨细胞生成的关键性细胞因子,通过 作用于破骨细胞上的受体 RANK,刺激破骨细胞形成、分化及活 化,增强骨吸收. OPG 竞争性结合 OPGL,阻断 OPGL 与其靶信号 受体 RANK 的结合,抑制 OPGL/RANK 对破骨细胞信号转导的活化,减 少破骨细胞生成，发挥抗骨质疏松作用. OPG 还能通过与 TRAIL 的竞争性结合，抑制 TRAIL 和死亡受体结合，来抑制 TRAIL 诱导细胞凋亡的作用. 反之，TRAIL 可结合 OPG,并相互 中和对方的功能9,即可间接解除 OPG 对 OPGL 的结合，抑 制它的抑制破骨细胞的发生和增加骨密度的作用. 可见 OPG 和 TRAIL 是相互抑制的. 我们从基因水平观察了不同浓度葡萄糖对 MG63细胞株中 OPG,OPGL 表达的影响，发现高糖能使 OPGLmRNA 表达增加,呈 剂量依赖性. 高糖同时能抑制 MG63细胞中 OPG mRNA 的表达, 使细胞内 OPG/OPGL 比率降低. 提示高糖对成骨细胞中 OPG/OPGL 水平的调节,可能是糖尿病导致骨质疏松症的机制之 一. 我们从基因及免疫组化的角度，还观察到了不同浓度葡萄 糖对 MG63细胞株 TRAIL 表达的