组蛋白乙酰化对衰老雌鼠胚胎发育影响的研究

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 组蛋白乙酰化对衰老雌鼠胚胎发育 影响的研究 1 前言 中国论文网 /8/view-13059430.htm 随着晚婚晚育政策的推行以及 “二胎政策”的放开，生殖健康越来越成 为人们关注的焦点。衰老的卵子会带来 包括流产在内的一系列问题，通过对衰 老卵子影响因素的研究，我们可以更好 地对卵子质量进行调控，提高生殖健康 能力。 为进一步探索与卵母细胞质量相 关的年龄的相关因素，我们在实验室比 较了年轻 C57BL/6 雌鼠（5 周）与 45 周雌鼠的 MII 卵母细胞的 mRNA 的各 个基因表达量。通过转录组测序发现， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 接近 5%的母源物质受到了年龄增长的 影响。有趣的是，有很多与表观修饰相 关的转录本受到了年龄增长的严重影响， 例如 DNA 甲基化转移酶、组蛋白乙酰 化酶等。 我们的研究是通过比较不同年龄 雌鼠的受精胚胎的发育能力发现衰老雌 鼠的生殖能力出现明显下降，并出现流 产、妊娠率低等现象。该研究通过在体 内和体外模拟方式明确了乙酰化升高是 卵母细胞衰老造成动物流产、妊娠率低 的一个重要原因，并且乙酰化的升高改 变了众多基因的表达，从而为人们提高 对卵母细胞衰老认识、进行胚胎质量控 制提供重要的证据。 2 方法 2.1 CD-1 雌鼠受精卵的获取 我们选取了 810 周龄的 CD-1 雌鼠获取受精卵和实验用卵母细胞。 2.2w 外 TSA 处理 通过对实验受体分别做添加去乙 酰化酶抑制剂 TSA，和不加 TSA 处理， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 放入胚胎培养箱观察发育。囊胚后移植 至假孕体内观察体内发育。 2.3 假孕雌鼠的制备 挑选健康 8 周龄左右性成熟雌性 CD-1 品系雌鼠，与同品系输精管结扎 公鼠合笼交配。之后通过检栓，挑选出 假孕雌鼠。 2.4 雌鼠胚胎移植 对雌鼠进行全身麻醉后，将要移 植的囊胚注入假孕鼠输卵管膨大部中。 2.5 免疫荧光染色 将要染色的胚胎，按流程进行清 洗、染色。 2.2.6 PCR 检测 按配方进行 PCR 鉴定。 3 数据分析 3.1 衰老雌鼠生殖能力下降 3.1.1 衰老雌鼠受精卵质量差 我们选取 6 周和 14 个月大的 CD-1 雌鼠作为研究对象。通过超数排 卵的手段对两种雌性雌鼠进行激素调节， 随后在注射完 HCG 后，将超数排卵的 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 雌鼠与雄鼠进行合笼，利用输卵管冲洗 的办法取出受精卵。通过在高倍光镜下 检测，我们发现衰老雌鼠的受精卵胞质 发黑，并呈颗粒化。该结果说明受精卵 的质量随着雌鼠年龄的增长而变差。 3.1.2 衰老雌鼠早期胚胎发育效率 低下 我们分别取年轻雌鼠（8 周）和 衰老雌鼠（14 月）的受精卵进行体外培 养观察。我们发现衰老雌鼠的胚胎发育 率随着细胞分裂次数的增多，逐渐下降 （图 3-1） 。囊胚率约为年轻雌鼠的一半。 该结果表明随着雌鼠年龄的增长，雌鼠 早期胚胎发育能力下降。 3.1.3 衰老雌鼠胚胎具有妊娠率低 并出现胎儿流产畸形的特点 为了更好地排除衰老个体对胚胎 发育的影响，我们所选取的假孕均为同 一周龄，即均为 8 周雌鼠。我们分别向 假孕雌鼠体内移植衰老雌鼠胚胎 51 枚， 年轻雌鼠胚胎 16 枚。在雌鼠孕期 19.5dpc 的时候，检测胎儿出生。我们 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 发现移植了衰老雌鼠胚胎的假孕雌鼠有 两个胎儿出生，而移植了年轻雌鼠胚胎 的假孕有 10 只胎儿出生，衰老雌鼠胚 胎严重降低了胎儿的出生率及妊娠率。 3.2 高组蛋白乙酰化水平是衰老 雌鼠胚胎生殖异常的一个主要原因 3.2.1 衰老雌鼠胚胎的乙酰化水平 升高 影响衰老雌鼠胚胎发育能力低下 的因素有很多。我们将研究的重点关注 在基因组的表观修饰上来。表观遗传修 饰包括 DNA 甲基化和组蛋白乙酰化等。 通过赖氨酸乙酰化的免疫荧光染色，我 们发现衰老雌鼠的乙酰化染色的荧光强 度极高（图 3-2） 。初步证明了衰老雌鼠 的乙酰化程度增高。 3.2.2 增加年轻雌鼠乙酰化程度获 得与衰老雌鼠一样生理表型 我们尝试在体外培养环境下，增 加年轻雌鼠胚胎的乙酰化程度进行体外 模拟实验。TSA 是一种去乙酰化酶抑制 剂，通过向胚胎培养液中添加该试剂， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 可以显著提升胚胎的乙酰化程度。随后， 我们通过向同为 8 周雌鼠的胚胎培养液 中添加 TSA 来增加年轻雌鼠胚胎的乙 酰化程度。 通过对到期雌鼠出生个数的比较， 我们发现 TSA 处理后的年轻胚胎的雌 鼠到期效率和年老雌鼠一致（图 3-3） 。 实验结果说明，乙酰化程度升高后年轻 雌鼠胚胎获得了和年老雌鼠胚胎一致的 生理表型。 3.2.3 TSA 处理的年轻雌鼠胚胎 具有和年老雌鼠类似的乙酰化程度 为了确定是否 TSA 处理后年轻 雌鼠胚胎的乙酰化程度和年老雌鼠类似， 我们通过免疫荧光的手段对胚胎进行染 色。发现经过 TSA 处理后的雌鼠胚胎， 具有了和年老雌鼠相类似的乙酰化程度。 结果说明，乙酰化程度改变是衰老雌鼠 胚胎质量变差的一个重要原因。 3.3 乙酰化程度改变导致了一些 关键性基因表达量改变 为了探究乙酰化程度改变为什么 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 会造成动物流产等现象，我们利用 qpcr 技术对年轻、年老、TSA 处理的胚胎受 精卵进行了基因表达量的鉴定，通过鉴 定，我们发现包括 Peg10 在内的多个对 胚胎发育到期的重要基因的表达量相对 于野生型较高，并存在显著差异（图 3- 4） 。因此，乙酰化程度改变很有可能是 增强了多个关键性基因的表达，从而导 致基因表达紊乱，造成了胎儿发育雌鼠 问题与障碍。 4 结论 1.衰老雌鼠胚胎的乙酰化水平增 高； 2.通过体外模拟发现乙酰化水平 升高是造成衰老雌鼠胚胎发育能力下降 的一个主要原因； 3.乙酰化程度增高，改变基因表 达水平使得基因表达