2010分子生物学课程期末考试-i,ii 答案

2007 级本科生分子生物学考试试题 I（100 分钟） 2010.7.05 系 学号 姓名 一、名词解释：（30 分，3 分/小题） 1. Molecular Biology 从分子水平上研究生命现象物质基础的学科。研究细胞成分的物理、化学的性质和变化以 及这些性质和变化与生命现象的关系，如遗传信息的传递，基因的结构、复制、转录、翻 译、表达调控和表达产物的生理功能，以及细胞信号的转导等 2. DNA methylation 在甲基转移酶的催化下，DNA 的 CG 两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基基团的化学 修饰现象。通常发生在 5胞嘧啶位置上，具有调节基因表达和保护 DNA 该位点不受特定 限制酶降解的作用。 3. Apoptosis 由死亡信号诱发的受调节的细胞死亡过程, 是细胞生理性死亡的普遍形式。凋亡过程中 DNA 发生片段化，细胞皱缩分解成凋亡小体，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬，不发生炎症。 4. SNP 是指在基因组上单个核苷酸的变异，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。指在基 因组上单个核苷酸的变异,包括置换、颠换、缺失和插入。 5. trans-acting 激活因子(如转录、翻译激活因子等 )调控基因表达时，由于蛋白质直接结合或间接作用， 引起基因表达激活或增强的调控作用。 6. metastasis 瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管或体腔，迁徙到他处而继续生长，形成与原发瘤同样 类型的肿瘤，这个过程称为转移。 7. biochip 广义的生物芯片指一切采用生物技术制备或应用于生物技术的微处理器。包括用于研制生 物计算机的生物芯片，将健康细胞与电子集成电路结合起来的仿生芯片，缩微化的实验室 即芯片实验室以及利用生物分子相互间的特异识别作用进行生物信号处理的基因芯片、蛋 白质芯片、细胞芯片和组织芯片等。狭义的生物芯片就是微阵列，包括基因芯片、蛋白质 2 芯片、细胞芯片和组织芯片等。 8. co-IP 用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该分子特异性结合的其他分子也会被带着一起沉淀 出来的技术。这种技术常用于验证蛋白质之间相互特异性结合。 9. signal pathway 当 细 胞 里 要 发 生 某 种 反 应 时 ， 信 号 从 细 胞 外 到 细 胞 内 传 递 了 一 种 信 息 ， 细 胞 要 根 据 这 种 信 息 来 做 出 反 应 的 现 象 ， 叫 做 信 号 通 路 。 10. hTERT 一种自身携带模板的逆转录酶，由 RNA 和蛋白质组成，RNA 组分中含有一段短的模板序 列与端粒 DNA 的重复序列互补，而其蛋白质组分具有逆转录酶活性，以 RNA 为模板催化 端粒 DNA 的合成，将其加到端粒的 3端，以维持端粒长度及功能。 二、简述题 （30 分） 1. PCR 引物设计的基本原则？（7 分） 引物长度：15-30bp ，常用为 20bp 左右。 引物碱基：G+C 含量以 40-60%为宜，G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异 条带。ATGC 最好随机分布，避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 引物内部不应出现互补序列。 两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免 3 端的互补重叠。 引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过 70%，引物 3末端连续 8 个碱基在待扩增 区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。 引物 3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是 G 和 C。 引物的 5 端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高 辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。 2. 阐述 IgG 抗体的分子结构，并说明其各片段的生物学意义? （8 分） 抗体是具有 4 条多肽链的对称结构，其中 2 条较长、相对分子量较大的相同的重链(H 链) ； 2 条较短、相对分子量较小的相同的轻链(L 链)。链间由二硫键和非共价键联结形成一个由 4 条多肽链构成的单体分子轻链有 和 两种，重链有 、 、 、 和 五种。 整个抗体 分子可分为恒定区和可变区两部分。在给定的物种中，不同抗体分子的恒定区都具有相同 的或几乎相同的氨基酸序列。可变区位于“Y“的两臂末端。在可变区内有一小部分氨基酸残 3 基变化特别强烈，这些氨基酸的残基组成和排列顺序更易发生变异区域称高变区。高变区 位于分子表面，最多由 17 个氨基酸残基构成，少则只有 2 3 个。高变区氨基酸序列决 定了该抗体结合抗原抗原的特异性。一个抗体分子上的两个抗原结合部位是相同的，位于 两臂末端称抗原结合片段。“Y“的柄部称结晶片段，糖结合在结晶片段上。 3. micro RNA 和 RNA 干扰概念有何不同，各自如何应用？（6 分） microRNA 是一类由内源基因编码的长度约为 22 个核苷酸的非编码单链 RNA 分子, 它们在动植物中参与转录后基因表达调控。大多数 microRNA 基因以单拷贝、多拷贝或基 因簇(cluster) 的形式存在于基因组中。 siRNA 有如下特点： 长度约在 22nt 左右，siRNA 一般是人工体外合成的，通过转染 进入人体内，是 RNA 干涉的中间产物；植物体内也存在内源的 siRNA。结构上， siRNA 是双链 RNA，siRNA 可作用于 mRNA 的任何部位，并与 mRNA 完全互补。 RNA 干扰即可应用于基因功能的研究，又可应用于疾病治疗以及新药研发等方面，有 广阔的应用前景。 4. 举出 9 种分子生物学研究常用技术及其作用？（9 分） PCR： 对体外目的基因进行大量扩增，并应用于定点突变 SNP：SNP 成为第三代遗传标志,人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与 SNP 有关 DNA 重组：指 DNA 分子内或分子间发生的遗传信息的重新共价组合过程。包括同源重组、 特异位点重组和转座重组等类型，广泛存在于各类生物。体外通过人工 DNA 重组可获得 重组体 DNA，是基因工程中的关键步骤。 Southern:用标记的 DNA 或 RNA 探针检测目的 DNA 技术 Nouthern：用标记的 RNA 探针检测目的 RNA 技术 RNA 干扰：一种分子生物学上由双链 RNA 诱发的基因沉默现象。当细胞中导入与内源性 mRNA 编码区同源的双链 RNA 时，该 mRNA 发生降解而导致基因表达沉默 Western: 根据抗原抗体结合检测目的蛋白的技术 免疫共沉淀：研究体内蛋白质之间相互作用的实验方法。 GST-pull down :在体外研究蛋白质之间相互作用的实验方法。 三、论述题 （35 分） 1. 乙肝病毒 HBV 的分子结构及其作用，并阐明乙肝病毒 x 基因的致癌作用机 4 理？（10 分） HBVDNA 负 链 有 四 个 开 放 区 ， 分 别 称 为 S、 C、 P 及 X， 能 编 码 全 部 已 知 的 HBV 蛋 白 质 。 S 区 可 分 为 二 部 分 ， S 基 因 和 前 S 基 因 。 S 基 因 能 编 码 主 要 表 面 蛋 白 。 S 基 因 之 前 是 一 个 能 编 码 163 个 氨 基 酸 的 前 S 基 因 ， 编 码 Pre S1 和 Pre S2 蛋 白 。 C 区 基 因 包 括 前 C 基 因 和 C 基 因 ， 分 别 编 码 HBeAg 和 HBcAg。 P 区 最 长 ， 约 占 基 因 组 75% 以 上 ， 编 码 病 毒 体 DNA 多 聚 酶 。 X 区 可 能 编 码 有 154 个 氨 基 酸 的 碱 性 多 肽 。 乙肝病 毒的 X 蛋白是 HBV 病毒的重要编码蛋白，具有致癌作用。X 蛋白通过反式激活作用可以 上调很多癌基因，下调抑癌基因。有研究发现 X 蛋白与 Survivin 蛋白可以协同作用，在 HBXIP 参与的情况下促进细胞转化。同时 X 蛋白可以影响 P53 的表达，进而也能导致细胞 凋亡途径的异常。不仅如此，X 蛋白对于 DNA 的修复作用也有影响。同时 X 蛋白可以影 响端粒酶活性以促进肿瘤发生。由此可见，HBV X 蛋白可以通过多中途径促进肝癌的发生。 2. 比较原核表达系统与真核表达系统的优缺点，并阐明其在应用上的不同？ （12 分） 1 最根本的区别是原核表达系统的表达系统是原核细胞; 真核表达系统则是在真核细胞里例 如酵母细胞, 昆虫细胞, 哺乳动物细胞中表达. 2,两种表达系统都是通过含有原核或者真核 启动子以及其他其他表达相关元件的质粒系统来实现外源基因的表达. 3,原核表达系统与真 核表达系统相比,表达量效率便于优化调整,表达量高. 但用来表达真核来源的外源基因时,由 于蛋白折叠和糖链修饰不同,因此其应用受限. 真核表达系统表达量相对较低, 虽然酵母和 昆虫系统表达量相对较高,但是在表达哺乳细胞来源基因同样存在折叠和糖链修饰的不足.真 核表达系统能得到具有蛋白活性的蛋白，有利于模拟真核细胞真实情况，近一步研究基因 和蛋白的功能。 3. 举例说明应用何种方法研究肿瘤发病的分子机理？（13 分） 以研究 HBx 蛋白和 survivin 蛋白协同致癌分子机制为例： 首先是建立稳定表达 HBx 和 survivin 蛋白的稳定细胞系，通过过量表达，检测两者协同后 的分子事件，例如肝癌分子标记物甲胎蛋白等的表达情况，气候通过克隆形成实验，动物 成瘤实验等检测两者协同对肝癌发生发展的影响。 为了近一步研究分子机制，可以通过 cDNA 芯片，microRNA 芯片等近一步研究两者协同 情况下的基因和 microRNA 的表达情况。 其后，可以通过 RNA 干扰技术，人为下调 HBx 和 survivin 的表达，然后检测上述分子标 5 记或 cDNA 芯片，microRNA 芯片等结果，以近一步了解该过程中的分子事件。 发现重要的基因后，可以通过近一步过表达和 RNA 干扰该基因，研究该基因所参与的信 号通路，近一步探索其作用的详细分子机制。 四、英译汉 （5 分） Cancer Res. 2010 Jun 15;70(12):4820-8. Myc-induced microRNAs integrate Myc-mediated cell proliferation and cell fate. Abstract The Myc pathway, often deregulated in cancer, is critical in determining cell fate by coordinating a gene expression program that links the control of cell proliferation with cell fate decisions. As such, precise control of the Myc pathway activity must be achieved to ensure faithful execution of appropriate cellular response and to prevent progressing toward a malignant state. With recent highlighted roles of microRNAs (miRNA) as critical components of gene control, we sought to evaluate the extent to which miRNAs may contribute in the execution of Myc function. Combined analysis of mRNA and miRNA expression profiles reveals an integration whereby the Myc- mediated induction of miRNAs leads to the repression of various mRNAs encoding tumor suppressors that block cell proliferation including p21, p27, and Rb. In addition, the proapoptotic PTEN tumor suppressor gene is also repressed by Myc-induced miRNAs, suggesting that Myc-induced miRNAs contribute to the precise control of a transcriptional program that coordinates the balance of cell proliferation and cell death. Myc 调节的 microRNA 参与 Myc 介导的细胞增值和细胞命运 Myc 通路在癌症中常常被异常调节，Myc 是细胞命运的重要决定引子，他可以去一些其他 的基因一起调节细胞增值和细胞命运。因此，Myc 通路的活性必须保证忠实准确的去调节 细胞反应，以避免细胞向肿瘤方向发展。最近，microRNAs 被认为对基因具有重要的调节 作用，我们探索需找参与 Myc 功能的 microRNAs。mRNA 和 microRNA 芯片结果揭示 Myc 诱导的 microRNA 参与了一些列的抑癌基因的表达抑制。这些抑癌基因主要是抑制细 胞增值的基因，包括 p21, p27, 和 Rb。另外，促凋亡的抑癌基因 PTEN 也被 Myc 诱导的 MicroRNA 抑制表达。这揭示 Myc 引导的 microRNA 参与了维持细胞转录系统的精确控制， 并一起调节细胞增值和细胞凋亡的平衡。 6 7 2007 级本科生分子生物学考试试题 II（ 100 分钟） 2010.7.05 一、名词解释（30 分，3 分/小题） 1、Real time PCR 在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个 PCR 进程，最后 通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 。 2、reverse genetics 反向遗传学是相对于经典遗传学而言的。经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物 质来研究生命的发生与发展规律。反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上， 通过对靶基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、基因插入缺失、基因置换等，再按组 成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研究生物 体基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内 容。 3、GST pull-down 将靶蛋白-GST 融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑 物,充当一种“诱饵蛋白”, 目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”( 目的蛋 白), 洗脱结合物后通过 SDS-PAGE 电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的 目的蛋白 4、subclone 用限制性酶切或 PCR 等手段从已经克隆的 DNA 中获得该克隆 DNA 的部分序列或改造 过的序列，再克隆到另外的新载体中的技术 5co-IP 用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该分子特异性结合的其他分子也会被带着一起沉 淀出来的技术。这种技术常用于验证蛋白质之间相互特异性结合。 6、transformation 8 通常指正常细胞经各种致癌剂处理后成为癌细胞的过程。也可指因外源基因导入使基因 型和表型发生永久性遗传改变的现象。 7、single nucleotide polymorphism 是指在基因组上单个核苷酸的变异，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。指在 基因组上单个核苷酸的变异,包括置换、颠换、缺失和插入。 8、apoptosis 由死亡信号诱发的受调节的细胞死亡过程, 是细胞生理性死亡的普遍形式。凋亡过程中 DNA 发生片段化，细胞皱缩分解成凋亡小体，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬，不发生炎症。 9、DNA methylation 在甲基转移酶的催化下，DNA 的 CG 两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基基团的 化学修饰现象。通常发生在 5胞嘧啶位置上，具有调节基因表达和保护 DNA 该位点不受 特定限制酶降解的作用。 10、reporter gene 是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴 定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因 相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控， 筛选得到转化体。 二、简述题 （30 分） 1、micro RNA 和 RNA 干扰概念有何不同，各自如何应用？（8 分） microRNA 是一类由内源基因编码的长度约为 22 个核苷酸的非编码单链 RNA 分子, 它们在动植物中参与转录后基因表达调控。大多数 microRNA 基因以单拷贝、多拷贝或基 因簇(cluster) 的形式存在于基因组中。 siRNA 有如下特点： 长度约在 22nt 左右，siRNA 一般是人工体外合成的，通过转染 进入人体内，是 RNA 干涉的中间产物；植物体内也存在内源的 siRNA。结构上， siRNA 是双链 RNA，siRNA 可作用于 mRNA 的任何部位，并与 mRNA 完全互补。 RNA 干扰即可应用于基因功能的研究，又可应用于疾病治疗以及新药研发等方面，有 广阔的应用前景。 2、分子克隆的基本策略？（6 分） 一个典型的基因克隆实验，主要有以下操作和结果： （1）包括有目的基因在内的 DNA 片断插入另一个 DNA 分子（克隆载体，通常是环状的） ， 9 形成重组 DNA 分子。 （2）重组 DNA 分子通过转化或其他类似的方法被导入受体细胞。大肠杆菌是使用较多的 受体细胞。 （3）在受体细胞中，克隆载体指导重组 DNA 分子复制，产生许多完全相同的拷贝。 （4）当受体细胞分裂时，重组 DNA 分子的拷贝进入子细胞，克隆载体的复制将在子细胞 中继续。 （5）大量分裂的受体细胞形成克隆：一个细胞群体，其中每个细胞都含有许多重组 DNA 分子的拷贝。 3、蛋白质组学的原理、基本方法和应用？（7 分） 蛋白质组意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表 达的全部蛋白质。蛋白质组本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质 的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病 发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识 基本方法为：首先提取蛋白质样品，然后利用二维电泳技术分离蛋白质，然后对蛋白质 进行检测，鉴定，解析蛋白质结构等。 传统的对单个蛋白质进行研究的方式已无法满足后基因组时代的要求。这是因为：(1) 生命现象的发生往往是多因素影响的，必然涉及到多个蛋白质。(2) 多个蛋白质的参与是 交织成网络的，或平行发生，或呈级联因果。(3) 在执行生理功能时蛋白质的表现是多样 的、动态的，并不象基因组那样基本固定不变。因此要对生命的复杂活动有全面和深入的 认识，必然要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究。 4、在 DNA、RNA 和蛋白质三个层面上分别各举出 3 种常用的分子生物学研究技术， 并说明其作用？（9 分） PCR： 对体外目的基因进行大量扩增，并应用于定点突变 SNP：SNP 成为第三代遗传标志,人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可 能与 SNP 有关 DNA 重组：指 DNA 分子内或分子间发生的遗传信息的重新共价组合过程。包括同源 重组、特异位点重组和转座重组等类型，广泛存在于各类生物。体外通过人工 DNA 重组可获得重组体 DNA，是基因工程中的关键步骤。 Southern:用标记的 DNA 或 RNA 探针检测目的 DNA 技术 Nouthern：用标记的 RNA 探针检测目的 RNA 技术 10 RNA 干扰：一种分子生物学上由双链 RNA 诱发的基因沉默现象。当细胞中导入与内 源性 mRNA 编码区同源的双链 RNA 时，该 mRNA 发生降解而导致基因表达沉默 Western: 根据抗原抗体结合检测目的蛋白的技术 免疫共沉淀：研究体内蛋白质之间相互作用的实验方法。 GST-pull down :在体外研究蛋白质之间相互作用的实验方法。 三、论述题 （35 分） 1、举例说明病毒感染与肿瘤发生的关系及其分子机制？（10 分 ） 病毒感染可以导致肿瘤的发生，例如 HBV 病毒的感染可以导致肝癌的发生。其致癌的分 子机制已取得一系列的研究成果，例如，乙肝病毒的 X 蛋白是 HBV 病毒的重要编码蛋白， 具有致癌作用。X 蛋白通过反式激活作用可以上调很多癌基因，下调抑癌基因。有研究发 现 X 蛋白与 Survivin 蛋白可以协同作用，在 HBXIP 参与的情况下促进细胞转化。同时 X 蛋白可以影响 P53 的表达，进而也能导致细胞凋亡途径的异常。不仅如此，X 蛋白对于 DNA 的修复作用也有影响。同时 X 蛋白可以影响端粒酶活性以促进肿瘤发生。由此可见， HBV X 蛋白可以通过多中途径促进肝癌的发生。 2、如何应用高通量筛选的方法研究细胞转化的分子机制研究？（12 分） 应用高通量筛选的方法需找细胞转化的分子机制已经成为分子生物学的重要手段。高通 量筛选) 技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体， 以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机分 析处理实验数据，在同一时间检测数以千万的样品，并以得到的相应数据库支持运转的技 术体系，它具有微量、快速、灵敏和准确等特点 目前一些常用的高通量筛选方法主要有：cDNA 芯片技术，蛋白质组学技术，启动子芯 片技术，microRNA 芯片技术，高通量测序技术等等。 3、可应用哪些方法研究细胞的功能？（13 分） 1 MTT: MTT 法又称 MTT 比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为 活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒 （Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中 的甲瓒，用酶联免疫检测仪在 490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在 一定细胞数范围内，MTT 结晶形成的量与细胞数成正比。 2 BrdU: 文全名 5-溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在 DNA 合成期（S 期） ，活体注射或细胞培养加入，而后利用抗 Brdu 单克隆抗体，ICC 染色，显 11 示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度， 对研究细胞动力学有重要意义。 流式细胞术 流式细胞术（Flow CytoMeter，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行 定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多 个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最 先进的细胞定量分析技术。 Transwell 细胞体外侵袭实验: 细胞体外侵袭实验主要应用于各种细胞因子对恶性肿瘤细胞 侵袭和转移的影响及一些抑制血管生成的新药研究 四、英译汉 （5 分） Cancer Res. 2010 Apr 1;70(7):2911-23. Malignant germ cell tumors display common microRNA profiles resulting in global changes in expression of messenger RNA targets. Abstract Despite their extensive clinical and pathologic heterogeneity, all malignant germ cell tumors (GCT) are thought to originate from primordial germ cells. However, no common biological abnormalities have been identified to date. We profiled 615 microRNAs (miRNA) in pediatric malignant GCTs, controls, and GCT cell lines (48 samples in total) and re-analyzed available miRNA expression data in adult gonadal malignant GCTs. We applied the bioinformatic algorithm Sylamer to identify miRNAs that are of biological importance by inducing global shifts in mRNA levels. The most significant differentially expressed miRNAs in malignant GCTs were all from the miR-371-373 and miR-302 clusters (adjusted P 0.00005), which were overexpressed regardless of histologic subtype yolk sac tumor (YST)/seminoma/embryonal carcinoma (EC), site (gonadal/extragonadal), or patient age (pediatric/adult). Sylamer revealed that the hexamer GCACTT, complementary to the 2- to 7-nucleotide miRNA seed AAGUGC shared by six members of the miR- 371-373 and miR-302 clusters, was the only sequence significantly enriched in the 3- untranslated region of mRNAs downregulated in pediatric malignant GCTs (as a gro