酶分析法ppt课件

酶 分 析 法教学目的和要求 l 熟悉：1酶活力的测定方法2酶法分析的测定方法l 了解：酶分析法的原理概 述l1.酶的概念 是生物体内产生并具有催化活性的 一类蛋白质 ，由于表现出特异的催化功能，因此酶被称为生物催化剂。l2.酶的应用 ：在体外进行催化反应l 用以制造某些产品l 用以去除某些物质l 用以识别某种化合物 属于 “酶分析法 ”l 用以测定某种物质l 酶是由 活细胞 产生的具有 催化作用 的特殊物质，又称 生物催化剂 。l 除极个别 RNA为催化自身反应的酶外，其余所有的酶都是 蛋白质 。l 生物体内 一切生化反应 都需要酶的催化才能进行！l 性能远远超过人造催化剂。l 产物（ product， P）l 底物（ substrate， S ）酶 的 概 念酶是特殊的催化剂(1) 生物大分子(2) 催化条件温和(3) 强酸、碱或高温下失活(3) 高选择性(4) 高催化效率机理：降低反应活化能，提高反应速度，不改 变平衡点。只起催化作用，本身不消耗。酶 的 特 点 概 括 如 下 ：概 述l3.酶分析法包括两种类型 ：l 一是以酶作为 分析对象 ，这类分析方法称为 “酶活力测定 ”。l 二是以酶作为 分析手段 ，用以测定样品中用一般化学方法难于检测的物质，通常将这类分析方法称为 “酶法分析 ”；4.两类酶分析法的区别l 相同：从原理到方法l 不同：酶活力测定法中 ， 是以酶为分析 对象 。使用的 底物 应该 过量 。l 酶法分析中 ， 是以酶为分析 工具 或分析 试剂 ,被检化合物（如： 底物 ） 是反应的限制因素酶法分析的优点1 用于复杂组分中结构或物理化学性质比较相近的同类物质的分离鉴定和分析。2 特异性强、干扰少、操作简单、样品和试剂用量少，测定快速精确，灵敏度高等特点。3 通过了解酶对底物的特异性，可以预料可能发生的干扰反应并设法纠正。4 可用偶联反应。5 无污染或污染很少的分析方法。n共同点：原理和方法相同，以酶的专一高效催化某化学反应为基础，通过测定酶反应的速率或生成物浓度来检测相应物质的含量。酶法测定的原则、酶活性的测定12、代谢物浓度的测定3、酶底物复合物酶反应动力学1、米氏方程 1） . 米氏方程nKm 即为米氏常数，nVmax为最大反应速度n当反应速度等于最大速度一半时 ,即 V = 1/2 Vmax, Km = S n上式表示 ,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。n因此 ,米氏常数的单位为mol/L。2、 Km米氏常数意义及推导过程 不同的酶具有不同的 Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数。 Km值只是在固定的底物，一定的温度和 pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的 Km值。 Km值表示酶与底物之间的亲和程度： Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低 ; Km值小表示亲和程度大 ,酶的催化活性高。 计算题l 要求酶按其最大反应速度的 99%的速度进行反应，求所需底物浓度 S。l 已知 S 9Km,求该酶体系的反应速度为何值？l 过氧化氢酶的 Km为 2.510 2mol/L，当底物浓度为 100mmol/L时，求反应速度达到最大速度的百分数？第一节 酶活力测定法l 一、基本概念 l 二、酶促反应的条件l 三、酶活力的测定方法l 四、测定过程中应注意的问题 一、基本概念l1.酶活力 ：指酶催化一定化学反应的能力。l2.酶活力的测定： 是测定一个被酶所催化的化学反应的速度。l3.酶活力测定的目的： 通过酶反应速度的测定，求得酶的浓度或含量酶活力 (enzyme activity)的测定 l 1酶活力l 酶活力 是指酶催化某一化学反应的能力，l 酶活力的 大小 可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率来表示，酶催化的反应速率愈大，酶的活力愈高；反应速率愈小，酶的活力就愈低。两者呈线性关系。l 所以 测定酶的活力就是测定酶促反应的速率 。 l 酶催化的 反应速率 可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。l 在实际酶活测定中一般以测定产物的增加量为准。l V = p / t p = v t 引起酶促反应速率降低的原因l (1)底物浓度的降低；l (2)产物浓度增加加速了逆反应的进行；l (3)产物对酶的抑制或激活作用l (4)随着时间的延长引起酶本身部分分子失活等。l 因此 测定酶活力，应测定酶促反应的初速率，反应初速率与酶量呈线性关系，因此可以用初速率来测定制剂中酶的含量。 检验酶反应和测定系统是否适宜的标准l测得的 反应速度 必须和 酶浓度 间有 线性的比例关系一、基本概念l4.酶反应的速度： 用单位时间内反应底物的减少或产物的增加来表示，酶反应的速度愈快所表示的酶活力愈高。l5.测定酶活力的方法 ：可用物理法、化学法或酶分析法等方法。一、基本概念l6.常用的酶分析法l 第一，终点法l 第二，取样测定法l 第三，连续测定法一、基本概念l7.酶的活性单位（国际单位 U） ：在 25 及最适条件下，每分钟能转化一个微摩尔 (mol)底物的酶量定为一个活性单位。l8.酶的比活性： 为一毫克 (mg)酶的活性单位数目。国际酶活力单位l 1961年 ,国际生物化学协会酶学委员会提出采用统一的 “ 国际单位 ” (U)来表示酶活力， 规定 为：在最适反应条件 (温度25) 下，每分钟内催化 1微摩尔 (umo1)底物转化为产物所需的酶量 ,定为一个酶活力单位，即l 1 U = 1 umol min。 酶的比活力 (specific activity)l 比活力 :每 mg蛋白质所含的酶活力单位数表示，l 比活力 =活力 U mg蛋白 =总活力 U/总蛋白 mgl 有时用每 g酶制剂或每 m1酶制剂含有多少个活力单位来表示 (U g或 U ml)。l 比活力大小的含义： 可用来比较每单位质量蛋白质的催化能力。比活力愈大，表示酶的纯度愈高。活力单位 (U)与比活力l U 速度单位l 每小时催化每小时催化 1克底物克底物l 每小时催化每小时催化 1ml某浓度溶液某浓度溶液l 每分钟催化每分钟催化 1ug底物底物l 酶产品质量评价中常使用比活力l 单位质量单位质量 酶产品中酶活力称 比活力 。l u/mg酶蛋白 u/ml酶蛋白l 国际单位（ IU）： 在实验规定的条件下（ 25，最适 pH、 最适底物浓度时）， 1ul标本，以每分钟能催化 1微摩尔底物的酶量为 1个国际单位。酶促反应速度的测定方法产物浓度变化曲线产物浓度变化曲线提问： 为什么反应速度会随时间减小？答案： 1.S降低；2.酶受到产物抑制提问： 用哪一个速度来表示该酶促反应的速度特征呢？反应初速度反应初速度 Vo反应 初 速度表示酶活力。提问： 仅用反应初速度大小对比酶活力行吗？答案 ： 不行， 还与酶的加入量及条件有关。酶活力测定实例l 首先 确定反应条件 20 、 pH=7， 底物浓度 6g/l（ 过量），加入 2mg固体脂肪酶l 第二 确定活力单位 如每小时催化 1克底物 1u= 1g/hl 第三 测算反应初速度 作产物甘油随时间增加的曲线，量出反应初速度值 ，换算为脂肪的消耗速度 如 8g/hl 第四 换算活力 8g/