脓汁和粪便标本中病原菌的检测-4

器材准备斜面培养物 4支，营养肉汤 4支，生理盐水 2支，镜油瓶、拭镜纸 1套，吸水纸 1本，载玻片 4张。染色瓶 6组，染色架 8个。医学微生物学实验综合性实验一v脓汁和粪便标本中病原菌的检测（四） 斜面培养物的观察 革兰染色法 肉汤接种法 显微镜油镜的使用斜面培养物的观察v 分别从斜面的正面和背面观察。v 从 普通平板 上挑取的黄色或白色菌落接种的斜面，菌苔的颜色，还是原来菌落的颜色，黄色或白色。v 从 伊红美蓝 平板上挑取的紫黑色或粉红色菌落接种的斜面，菌苔已经没有原来菌落的颜色。菌苔灰白色、表面湿润、光滑、不透明（紫黑）或半透明（粉红）。 为了讲解方便，以后的实验，仍然 沿用 初次分离得到菌落的颜色，紫黑色或粉红色。v 从斜面上取菌时，不管是涂片，还是接种，每次只取半个小菌落大小的菌量；接种环或接种针在培养基表面轻轻刮一下即可。 细菌染色法v单染色法 ：只用一种染料染色， 如美蓝或复红，能清楚观察菌体大小、形态与排列， 不能鉴别细菌。v复染色法 （鉴别染色）：采用两种或两种以上的不同染料进行先后染色，可将细菌染成不同的颜色，以便鉴别细菌。 抗酸染色 :用于检查结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌等抗酸性细菌，阳性者为红色。 特殊染色 ：荚膜染色，芽胞染色，鞭毛染色，极体染色（用于白喉杆菌异染颗粒染色）。结核分枝杆菌抗酸染色麻风分枝杆菌抗酸染色产气荚膜梭菌荚膜Hiss 染色破伤风 梭 菌芽胞芽胞染色 变形杆菌鞭毛 Leifson染色 白喉棒状杆菌异染颗粒 Albert染色 革兰染色法 Gram Staining革兰染色法是丹麦内科医生 Christain Gram于 1884年创立的一种细菌染色方法，已有120多年的历史，仍在广泛使用，是细菌学中最为经典的染色法 。革兰染色法原理的三种学说v 通透性学说 ： G+菌细胞壁结构比较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，酒精不易透入，反而可使细胞壁脱水而形成一道屏障，阻止染料向细胞外渗。 G-菌细胞壁比较疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质，易被酒精溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫 碘复合物容易被酒精脱出。v 等电学说 ： G+菌等电点 (pH2 3)比 G-菌 (pH4 5)低，一般染色时染液的酸碱度在 pH7.0左右，电离后阳性菌带的负电荷比阴性菌多，因此与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。v 化学学说 ： G+菌细胞内含有某种特殊化学成分，一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它与染料 媒染剂复合物结合，使已着色的细菌不易脱色。 革兰染色的意义v 鉴别细菌：把细菌分成 G+和 G-两大类。v 选择抗菌药物： G+球菌 对青霉素敏感 ,G-杆菌 耐药。v 了解细菌的致病机理： G+菌大多产生外毒素 ,G-菌产生内毒素。革兰染色的步骤涂片 干燥 固定 染色接种环取生理盐水 3 4ul， 2滴。菌苔少许（ 1mm小菌落的半量）与盐水混匀，涂成 1cm2。涂毕 环移至涂膜中央侧立，环内菌膜破裂，接种环 灭菌。涂片的制备甲 黄色，紫黑。 乙 黄色，紫黑。丙 白色，粉红。丁 白色，粉红。涂片涂片干燥固定革兰染色方法步骤涂片 干燥 固定 结晶紫 初染 1分钟 水洗 卢戈碘液 媒染 1分钟 水洗 95乙醇 脱色约 20秒钟 水洗 稀释复红 复染 1分钟 水洗 吸干 ,镜检。 取菌适量 ,涂片均匀 ,水洗轻缓 ,脱色适当。 影响革兰染色的关键是涂片太厚和脱色。革兰阳性菌 革兰阴性菌G+链球菌G-双球菌G+杆菌 G+短杆菌G-弧菌 G-螺菌甲 黄色 , 乙 白色 , 丙 紫黑 , 丁 粉红。标记：组号，颜色36 培养 4小时4 5108cfu/ml液体培养基接种 Broth Transfer 悬浮法 Suspending Method细菌在液体培养基的生长情况细菌在液体培养基的生长情况v 均匀浑浊：例如金黄色葡萄球菌 , 大肠杆菌。v 表面生长形成菌膜：例如枯草杆菌。v 沉淀生长：例如链球菌。生物安全警告v 本次实验操作，可产生几十至几百个微生物气溶胶颗粒。v 气溶胶粒径 100um沉降很快 , 50um在 0.4s内扩散开 , 5um通过呼吸道直接到达肺泡。v Pike博士对实验室感染统计分析结果发现，不明原因的感染高达 82%，大多数是气溶胶在空气中扩散引起的。v 实验时应坐着， 在火焰周围 10 20厘米内操作，保持安静、有序，尽量少说话、少走动，以免感染病原菌。100倍浸油物镜使用方法v 油镜放入光路之前，一定要在标本的观察部位上加一滴浸油。v 旋转物镜转盘，使油镜进入光路，用微调旋钮对好焦距。v 如果浸油内有气泡，会影响观察，可稍微旋转物镜转盘，使油镜来回通过 1 2次浸油，排除油内气泡。香柏油折射率 n=1.515空气折射率 n=1.00玻片折射率 n=1.52油浸镜的原理光线滴加香柏油可使光线更多进入物镜 ,避免光线通过折射率低的空气而散失 ,以提高物镜的分辨率 ,使物象明亮清晰。放大倍数：目镜10倍 物镜 90或 100倍显微镜油镜的使用 P13v 10 物镜 标本位置 滴加香柏油 100 油镜 浸泡油中 ,几乎与标本接触（工作距离 0.13mm） 细调节调焦，观察物像 记录结果 关闭电源。v 油镜处理：擦镜纸拭去香柏油 擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（ 7:3）混合液擦拭 擦镜纸擦拭油镜。v 显微镜罩上防尘罩 横放 在实验柜内。 (顺德校区）实验台两侧的电源插座，只能插入一个插头，请选择离你最近的电源插座。 （校本部）实验台中间，三个位的插座，中间那位插孔没有电，不能使用，只能用两侧的插座。 v 革兰染色法 P15甲 黄色，紫黑 乙 黄色，紫黑丙 白色，粉红 丁 白色，粉红v 肉汤接种法 P10 甲 黄色 乙 白色 丙 紫黑 丁 粉红v 油镜的使用 P13 10 物镜 标本位置 滴加香柏油 100 油镜 浸泡油中 ,几乎与标本接触（工作距离 0.13mm） 细调节调焦，观察物像 记录结果 关闭电源 擦镜纸拭去香柏油 擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（ 7:3）混合液擦拭 擦镜纸擦拭油镜。思考题v革兰染色法的关键步骤是什么 ?为什么 ?v染色时为什么通常要用新鲜的细菌培养物 ? v如何使用油镜 ?实验小结v 用普通平板，从浓汁标本中分离得到 黄色 、 白色 两种菌落，这两株细菌，显微镜油镜下均为 G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌。结合菌落色素，这两株葡萄球菌可能是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。电镜 油镜葡萄葡萄球菌三个种的 鉴别试验 金黄色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 腐生葡萄球菌血 浆 凝固 酶 + - -甘露醇 发 酵 + - -新生霉素敏感性 S S RA蛋白 + - -注：敏感（ Sensitive S） , 耐 药 （ Resistant R）。v用伊红美蓝平板 ,从粪便标本分离、获得紫黑色和粉红色半透明两种菌落。 紫黑色 菌落是能分解乳糖的非致病菌大肠埃希菌。 粉红色 菌落是不能分解乳糖的致病菌 。显微镜下，均为 G-杆菌，散在排列，从形态上不能鉴别是什么细菌。电镜 油镜常用器材摆放顺