第三章-基因工程部分

第 3章基因工程原理王金发L1基因工程是 20世纪 70年代发展起来的遗传学的一个分支学科2基因克隆操作3基因工程的应用45 基因工程的对象是基因，所以如果是获得商品的话，就是 基因的产品 ，或是改变了遗传性的 细胞 和 个体 。如果要获得效益的话，除了经济效益之外，还有巨大的社会效益。 基因工程的对象是基因，而 基因要安居才能乐业 ，也就是说基因需要在宿主细胞中工作，这样，基因工程同一般的土建工程的根本差别在于， 它需要在体外操作，然后送到细胞中去进行表现 。3.1 基因工程的特点63.1.1 基因工程与遗传工程遗传工程 (genetic engineering)一词产生于 19世纪 20年代，是遗传学和工程学相结合的一门技术科学。借用工程技术上的设计思想 , 在离体条件下 ,对生物细胞、细胞器、染色体或DNA分子进行按图施工的遗传操作 ,以求 定向地 改造生物的遗传性。遗传工程的概念有广义和狭义之分。广义的遗传工程包括传统遗传操作中的杂交技术和现代遗传操作中的基因工程和细胞工程 , 狭义的遗传工程仅指基因工程。73.1.2 生物技术生物技术 (biotechnology) 又称生物工艺学 , 生物工程学。是根据生物学、化学和工程学的原理进行工业规模的经营和开发微生物、动植物细胞及其亚细胞组分 , 进而利用生物体所具有的功能元件 (如基因、蛋白质 )等来提供商品或社会服务的一门综合性科学技术。基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等是生物技术的主要内容。8基因工程 (gene engineering)又称基因操作 (gene manipulation),重组DNA(recombinant DNA)。 基因工程是以分子遗传学为理论基础 ,以分子生物学和微生物学的现代方法为手段 ,将不同来源的基因 (DNA分子 ), 按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子 ,然后导入活细胞 , 以改变生物原有的遗传特性 ,获得新品种 , 生产新产品 , 或是研究基因的结构和功能。9体外操作与细胞内表达10细胞工程 (cell engineering) 应用细胞生物学的原理和方法 ,结合工程学的技术手段 ,按照人们预先的设计 ,有计划地改变或创造细胞遗传性的技术 ,以及在体外大量培养和繁殖细胞 ,或获得细胞产品 ,或利用细胞体本身的技术领域。 主要内容包括细胞融合、细胞拆合、染色体转移、基因转移、细胞或组织培养等。由于所用细胞的来源不同，细胞工程又分为微生物细胞工程、植物细胞工程、动物细胞工程等 。 11植物细胞工程 12细胞分泌工程根据细胞内蛋白质合成和运输理论而发展起来的一项新的细胞工程技术，主要是通过对基因改造，如基因缺失、多效分泌突变、周质泄漏突变或加接信号肽等措施，促进基因产物分泌的技术。13酶工程 (enzyme engineering) 又称酶技术。它是围绕着酶所特有的生化催化特性 ,结合现代的技术手段 ,在体外模拟或在常温常压下生成酶反应的产品以及利用重组 DNA技术定向改变酶 ,进行酶的修饰 ,或酶的全人工合成。 其主要内容包括酶的化学修饰、酶的固定化、酶反应器等。14蛋白质工程 (protein engineering) 是更广义上的包括酶工程在内的蛋白质修饰操作 ,通过对蛋白质及酶的化学修饰及基因改造获得具有特殊功能的非天然蛋白质的技术。 主要是根据蛋白质的结构和功能间的相互关系 ,利用基因工程技术 ,或用化学方法 ,合成基因 ,改造基因 ,以便合成新的蛋白质 ,或改变蛋白质的活性、功能以及溶解性等。15发酵工程 (fermentation engineering) 又称微生物工程 ,微生物发酵工程。 利用生物 ,主要是微生物的某种特定功能 ,通过现代化工程技术手段 ,生产有用物质 , 或把微生物直接用于某种工业化生产的一种技术体系。 主要内容包括菌种选育 , 发酵生产微生物 ,或植物细胞的代谢产物 , 生产微生物菌体 ,最佳培养条件的优化组合等。 163.2 基因工程技术的诞生3.2.1 基因工程的技术准备基因工程技术的诞生不仅依赖于基因分子生物学理论的发展，同时也有赖于一些重要的分子生物学研究方法的建立。最重要的技术准备是 限制性酶的分离纯化 、 DNA连接酶的分离 、 大肠杆菌转化技术的突破 。 到 1970年，这三大技术都已经建立， “ 万事齐备，只欠东风 ” 了。到了 1972 1973年，两位科学助产士 Berg和Cohen将基因工程接到了人间。173.2.2 基因工程技术的诞生18第一个重组体的构建1972年，美国斯坦福大学 P.Berg等在 PNAS上发表了题为 “Biochemical methode for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40:circular SV40 DNA molecules cotaining lamda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2904-2909, 1972”， 标志着基因工程技术的诞生 。19第一个重组体构建20SV40病毒是猿猴病毒，是一种直径为450的球形病毒，分子量为 28106道尔顿。 SV40的 DNA是环状双链结构，全长 5243个碱基对。 SV40DNA上有一个限制性内切酶 EcoR 的切点 。21SV40病毒22 当获得二聚体 SV40DNA后， Berg等就证明了环状 DNA被内切酶切成线性DNA后能够重新环化，并且能够同另外的分子重组。 于是他们进行第二步的实验就是从dvgal DNA中制备含有 E.coli的半乳糖操纵子 DNA， 用上述同样的方法进行重组连接，并获得成功 。23第一个有功能重组体的构建 虽然 Berg的工作具有划时代的意义，但是他们并没有证明体外重组的 DNA分子具有生物学功能。 1973年， S.N.Cohen等在美国 PNAS上发表了题为 “Construction of Biologically Functional Bacterial Plasmid In Vitro” （ S. N. Cohen, A. C. Y. Chang, H. W. Borer, and R. B. Helling, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:3240-3244, 1973）的论文，宣布体外构建的细菌质粒能够在细胞中进行表达 ,从而完善 了 Berg开创的基因重组技术 。24Boyer and Cohen25 质粒 pSC101的获得In 1972, Cohen constructed a new plasmid beginning with DNA isolated from E. coli. Cohen named the plasmid pSC101 (“SC“ for Stanley Cohen).The new plasmid had three important features: it had only a single recognition site where EcoRI would cut the molecule, thus identifying the spot where the plasmid would open; (2) it had a sequence of nucleotides called an origin of replication, which is needed to initiate DNA replication; such a sequence stimulates plasmids to multiply in a host organism; (3) it contained a gene for resistance to the antibiotic tetracycline; thus, bacteria having the plasmid could resist the effects of tetracycline, whereas bacteria lacking the plasmid would be killed by the tetracycline. Cohen在重组 DNA技术中杰出贡献26pSC101质粒 DNA27 质粒 pSC101对 大肠杆菌的转化技术突破 Another key characteristic of Cohens plasmid was the ease of inserting it to a host cell. Cohen found that he could insert plasmids to fresh bacteria by suspending the latter in cold calcium chloride, then rapidly heating the bacteria to 42oC. So treated, the bacterial wall and plasma membrane open to permit the plasmids to pass through and into the cytoplasm.Cohen在重组 DNA技术中杰出贡献28 Cohen与 Boyer合作创建重组 DNA分子 To some historians, the discipline of DNA technology came into being over pastrami sandwiches at a local delicatessen in Waikiki Beach. The year was 1972. It happened that Herbert Boyer was at a scientific conference in Hawaii speaking about the EcoRl restriction enzyme. Stanley Cohen was in the audience. After the presentation, Cohen invited Boyer to lunch to explore their possible collaboration on a series of experiments. The two researchers sat and considered the experiments that would send DNA technology into a new era.Cohen在重组 DNA技术中杰出贡献29 Cohen与 Boyer合作创建重组 DNA分子Cohen had been conducting fruitful experiments with plasmids, but he was experiencing difficulty cutting open the plasmids. Boyers EcoRI enzyme seemed to be the ideal solution, so Cohen suggested they join forces. They would use his plasmids and Boyers enzyme to recombine the plasmid DNA. First