第32章rna的生物合成与加工

第 32章 RNA的生物合成与加工lDNA指导的 RNA合成lRNA的转录后加工lRNA指导的 RNA合成一、一、 DNA指导的指导的 RNA合成合成RNA的生物合成包括 转录 和 RNA的 复制（一） DNA指导的 RNA聚合酶1、 DNA指导的 RNA聚合酶催化 RNA合成的特点：（ 1）不需引物 . （ 2）原料： NTP（ 3）合成方向： 5/3/ 端（ 4）模板 ：模板是 DNA,在 体内 只能以 DNA一条链为模板转录，叫不对称转录，转录的链叫 模板链 (有意义链或 负链 ),另一链叫 编码链 (反意义链或正链 )（ 5）促进因子 :Mg2+能促进聚合反应 .（ 6）无 3/5/ 外切酶活性，也无 5/3/ 外切酶的活性，过去认为 RNA聚合酶无校对功能，现在认为有校正功能，只是校正功能有限 .2、大肠杆菌 RNA聚合酶全酶的组成：由 5个（有的书上是 6个）亚基组成，分别是 、 、 、 /、 和 组成， 叫起始亚基，功能是辨认起始位点，又叫起始亚基；2和 /组成核心酶，核心酶没有启动功能，它的功能是在已开始合成的链上移动，边移动边解开双链，边 按5/3/ 方向延长核苷酸链， 亚基相对分子质量较小，功能不清楚。酶的活性中心内有 Zn2+.原核细胞中只有一种 RNA聚合酶3、大肠杆菌 RNA聚合酶结构与功能：酶的形状象一个多突起的椭球体（ 1） 亚基位于酶的一端，功能是：酶的组装和识别启动子并与之结合并使转录起始。（ 2） 和 /亚基，是最大的两个亚基，形状象螃蟹的前螯，功能是：与模板 DNA结合，结合核苷酸底物，催化磷酸二酯键形成，是 酶的催化中心 。（ 3） -亚基，窄而长，分为 4个区， 2区 与启动子的 -10序列结合并解开双螺旋， 4区 与启动子的 -35序列 结合， 1区和 3区起调节作用。（ 4）大肠杆菌）大肠杆菌 RNA聚合酶的活性中心有多个通道，聚合酶的活性中心有多个通道， 和和 /亚基之间的裂缝为亚基之间的裂缝为 DNA入口的通道入口的通道 ，进入活性中心的，进入活性中心的DNA遇到遇到 蛋白质壁蛋白质壁 产生转折，促使双链解开，模板链与非产生转折，促使双链解开，模板链与非模板链分开分别进入两通道并在出口处重新形成双螺旋模板链分开分别进入两通道并在出口处重新形成双螺旋（二）转录单位、启动子和转录因子1、转录单位：起始于 DNA模板的一个特定位点，在另一位点终止 (终止子 )，此转录区域称为一个转录单位 。转录 起点 左边的序列叫 起始点上游序列 ,在上游序列中有 启动子 ，右边的序列叫 下游序列，即转录区 .以转录起点以合成第一个核苷酸为界 (有的书以启动子为界 ),上游的 DNA碱基记为负 (-),下游的记为正 (+).2、启动子：是能被 RNA聚合酶的 -亚基识别并结合以开始转录的一段 DNA序列。利用 足迹法 和 DNA测序法 能确定启动子的核心脱氧核苷酸序列3、转录因子： RNA聚合酶起始转录需要的辅助因子，辅助因子的作用或是识别 DNA的顺式作用元件，或是识别其它因子，或是识别 RNA聚合酶。4、启动子的共有序列：l 共有序列可以不连续，从起点上游约 -10序列处找到共有序列 TATAAT，含 6bp，叫 Pribnow框（ box框） 或称为 -10序列 ，实际位置在不同启动子中略有不同；在box框中各碱基出现的频率为 T80A95T45A60A50T96，该序列含有 A-T碱基较多，容易解开双螺旋。l 在起点上游约 -35序列处也有一共有序列T82T84G78A65C54A45。-35序列提供了 RNA聚合酶的识别信号， -10区域有助于解开双螺旋。启动子的序列多种多样，具有共有序列是常见的结构，但最弱的启动子没有 -35序列（三）原核细胞的转录过程l 模板识别与转录起始l 链延长：l 链终止： 不依赖于 因子的终止；依赖与 因子的终止二、二、 RNA的转录后加工的转录后加工1、转录合成的 RNA,叫原初转录产物，原初 RNA经过一定程度的加工和修饰，才能变为成熟的 mRNA.。 mRNA作为蛋白质的合成模板 ,一个 mRNA可以为一条多肽链编码 ,也可为多条多肽链编码，为一条多肽链编码的 mRNA叫 单顺反子 ,为二条或多条多肽链编码的为 多顺反子。2、真核细胞的 mRNA为单顺反子 ,因为真核细胞功能相关的基因不连在一起形成操纵子 ,不产生多顺反子 .原核细胞的 mRNA结构简单 ,由于功能相近的基因连在一起形成操纵子一块转录 ,产生多顺反子 .3、原核生物的 mRNA除少数外，一般不进行加工，转录和翻译可同时进行。但 rRNA和 tRNA需经过加工才能形成活性 RNA；真核生物的 mRNA、 rRNA和 tRNA都需要加工（一）真核生物 mRNA前体的一般加工：1、真核细胞 mRNA的原初转录产物是分子量极大的前体 ,在核内加工过程中形成大小不等的中间物 ,称为核内不均一 RNA(hnRNA),有一小部分 经进一步加工成为成熟的 mRNA2、把 hnRNA加工为成熟 mRNA的过程包括：（ 1） /-端形成帽子 (保护 mRNA不被 5/-核酸外切酶降解 )（ 2） 3/-端形成多聚腺苷酸的尾巴 ,尾巴不能阻止 3/-核酸外切酶的降解作用 ,尾巴越长 ,3/-核酸外切酶作用的时间越长 ,mRNA的寿命越长 .（ 3）剪去内含子转录的 mRNA片段 ,把外显子转录的mRNA连接起来 .（ 4）链内部核苷被甲基化（ 1） 5/-加帽l 真核生物 mRNA5/-端都有帽子，在 hnRNA分子中就有帽子结构，在 hnRNA分子的 5/-端为三磷酸 嘌呤核苷 ；转录起始后不久在 RNA三磷酸酯酶的催化下从 5/-端脱去一个磷酸，然后在 mRNA鸟苷酰转移酶催化下，与GTP反应生成 5/,5/-三磷酸相连的键，并释放出焦磷酸；最后在甲基转移酶催化下，以 S-腺苷甲硫氨酸（ SAM）提供甲基进行甲基化，产生帽子结构l5/-帽子的功能：确切功能不十分清楚，推测它可能在翻译过程中被识别和对 mRNA起稳定作用。（ 2） 真核细胞 mRNA3/-加尾l 真核细胞 mRNA的 3/-端通常都有 20200个腺苷酸残基构成的多聚腺苷酸的尾巴结构，核内的 hnRNA3/-端也有多聚腺苷酸形成的尾巴， hnRNA的尾巴比 mRNA的尾巴略长，平均为 150200个腺苷酸残基。l 病毒的 mRNA3/-端也有多聚腺苷酸尾巴。 真核细胞和病毒的 mRNA的 3/端存在加尾信号 AAUAAA（ 3） 剪去内含子，连接外显子l 真核生物的基因是断裂基因，但也有少数编码蛋白质的基因及 tRNA和 rRNA基因是连续的。断裂基因的外显子和内含子一起转录，转录产物经过剪接除去内含子部分，将外显子链接起来。l 内含子有多种多样的结构，剪接机制也多种多样。剪接机制共有 4种方式：类型 自我剪接类型 也是自我剪接核 mRNA剪接体剪接核 tRNA的酶促剪接。l 在某些生物中， RNA也是遗传信息的载体，也能复制合成与自身相同的分子，某些病毒 RNA，当它侵入到宿主细胞后，可借助复制酶（ RNA指导的 RNA聚合酶）进行病毒 RNA的复制。l 如大肠杆菌的噬菌体有 f2、 MS2、 R17和 Q所含的核酸都是 RNA，当他们侵入到宿主细胞后，利用 RNA复制酶合成病毒 RNA。三、三、 RNA指导下指导下 RNA和和 DNA合成合成（一）（一） RNA指导下指导下 RNA和和 DNA合成合成1、噬菌体 QRNA的复制2、病毒 RNA复制的主要方式（二）（二） 逆转录作用（逆转录作用（ RNA指导的指导的 DNA合成合成 ）1970年 Temin和 Mizufani等人分别从致癌病毒中发现了以RNA为模板催化合成 DNA的酶叫逆转录酶 ,也叫 RNA指导得 DNA聚合酶 .当逆转录病毒感染宿主细胞时 ,单链 RNA病毒和酶一起进入宿主细胞 .1、逆转录酶（ RNA指导的 DNA聚合酶）（ 1）逆转录酶催化 DNA合成所需条件：l 底物： dNTPl 模板： RNAl 方向： 53l 逆转录酶中含有 Zn2+l 引物： tRNA(不同生物引物是不同氨基酸的 tRNA)，需要引物具有 3OH末端，在引物的 3/-末端按 53 方向，合成一条与 RNA模板互补的 DNA单链，这条 DNA单链叫做互补与 RNA的 DNA，它与 RNA模板形成 RNA-DNA杂交体。随后又在逆转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以杂交体的 DNA为模板合成第二条 DNA链。形成的双链 DNA（ cDNA）（ 2）逆转录酶也是多功能酶，主要包括以下几种活性 : DNA聚合酶活性；以 RNA为模板，催化 dNTP聚合成DNA的过程。反转录酶不具有 35 外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的 DNA错误率比较高 ,一般每加 20000个脱氧核苷酸就会出现一个错误的核苷酸 ,所以单链 RNA病毒突变率高。 核糖核酸酶 H（ RNase H）的活性；由逆转录酶催化合成的 cDNA与模板 RNA形成的杂交分子，将由 RNase H从RNA5端水解掉 RNA分子。 DNA指导的 DNA聚合酶活性：以反转录合成的第一条 DNA单链为模板，以 dNTP为底物，再合成第二条 DNA链。除此之外，有些反转录酶还有 DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体 DNA中有关。 2、逆转录过程、逆转录过程（ 1）逆转录病毒的 RNA、引物和酶（逆转录酶和整合酶）进入宿主细胞，在宿主细胞的胞质中发生逆转录作用，先形成 cDNA。（ 2） cDNA进入宿主细胞核，在整合酶帮助下整合到宿主细胞的染色体 DNA上，叫前病毒，前病毒随宿主细胞染色体 DNA复制而复制，只有整合的前病毒 DNA转录的mRNA才能指导蛋白质的合成。逆转录过程复杂：3、逆转录的意义l 逆转录的发现对于基因工程技术起了很大的推动作用，逆转录酶目前它已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取 mRNA并以它为模板，在反转录酶的作用下，合成出互补的 DNA(cDNA)，可构建出 cDNA文库 (cDNA library)，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。逆转录病毒引起癌症和艾滋病l 绝大多数逆转录病毒侵入宿主细胞后 ,并不杀死宿主细胞 ,它们整合到宿主 DNA 分子上并随之一起复制 ,但有些病