放线菌新种分类鉴定 ppt课件

放线菌新种分离鉴定1 实验目的2 实验方法3 实验结果4 总结2011/12/28 11、 实验目的2011/12/28 2本实验通过对分离得到的放线菌新种从形态学、生理生化反应特征、和分子遗传分类学方面进行鉴定，证明其是以前从未发现的新种。2、 实验方法2.1 分离方法2.3 鉴定方法表 观 特征化学分 类基因型分 类2011/12/28 32.2 16SrRNA基因序列测定2.1 分离方法2011/12/28 4近年来出现了胞外多糖胶与动孢溶液相结合的分离方法、再水化 -离心 法、极高频辐射法、噬菌体定向分离法和蔗糖梯度离心法等用于稀有放线菌选择性分离的方法。2011/12/28 52.2 16SrRNA基因序列测定放线菌基因组的提取16SrRNA基因扩增胶回收连接转化测序研究A 电镜观察B 培养特征C 生理生化特征2011/12/28 62.3.1 表观特征A. 电镜取菌体后 ,3% 戊二醛固定 4h, 0.1M磷酸缓冲液漂洗。酒精梯度脱水，在 30% 、 50、 70、 80% 、 100依次脱水，其中 100酒精 2次，每次 10min。 乙酸异戊脂置换， 50% 一次， 100% 两次。Eiko公司 XD-1型二氧化碳临界点干燥器干燥， Eiko公司 IB-3型离子镀金仪喷金镀膜。 JEOL公司 JSM-840扫描电镜观察。2011/12/28 7B. 培养特征参照国际链霉菌规划中有关放线菌的培养特征描述所采用的标准培养基进行培养特征测定。所用培养基有 :ISP2、 ISP3、 ISP4、 ISP5、察氏琼脂、马铃薯浸汁琼脂、营养琼脂 ，平板接种， 28 培养 7， 14， 21， 28d后分别观察并记录基内菌丝、气生菌丝的生长情况及可溶性色素。2011/12/28 8C. 生理生化实验生理生化特性的测定主要包括 :pH、盐浓度和温度耐受性， 明胶液化，淀粉水解，脲酶的产生，牛奶胨化和凝固，硝酸盐还原， H2S的产生，黑色素的产生，唯一碳、氮源利用等试验。2011/12/28 9a. pH、盐浓度和温度耐受性upH耐受实验在高氏一号培养基中分别加入 pH缓冲液，空白培养基作阴性对照， 28培养，每周观察一次，四周结束，重复 2次。u温度耐受实验将菌株接种在高氏一号培养基上，分别在 4 、 10 、 16 、 20 、28 、 37 、 45 培养，每周观察一次，四周结束，重复 2次。u盐耐受实验高氏一号培养基内加入不同浓度的 NaCI(l%， 3%， 5%， 7%， 10%， 15%， 20%)28 培养，每周观察一次，四周结束，重复 2次。2011/12/28 10b. 明胶液化取明胶培养基试管作穿刺接种，另有两支不接种作空白对照。于 28C培养箱中培养。培养 2、 7、 10、 14和 30天的试管，放入 4C冰箱或置于冷水中 30min，然后进行观察。如明胶凝块部分或全部变为可流通的 液体 ，则明胶水解阳性 。如明胶凝块呈 固体 ，则明胶水解 阴性 。若菌体未生长，可能是不能在明胶培养基上生长。2011/12/28 11c. 淀粉水解将菌株点种在淀粉琼脂平板上，待菌落生长良好时，在菌落周围滴加碘液检测淀粉水解酶活性的强弱。滴加碘液后培养皿背景呈蓝黑色 ,菌落四周若不变色，或移开菌落后滴加新碘液，菌落下得培养基仍 不变色 ，表示淀粉水解 阴性 ；若变成 透明无色 则为 阳性 ，说明产生淀粉酶水解淀粉。2011/12/28 12d. 脲酶的产生e. 牛奶凝固与胨化将待测菌种接种在脱脂牛奶管中，观察牛奶凝固与胨化现象。若牛奶有凝块则为凝固，继续培养，凝固后有液体出现，进一步水解成液体，则为胨化，一般先凝固后胨化。有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生 2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶，因为不论底物尿素是否存在，细菌均能合成此酶。其活性最适 pH为 7.0。挑取 1824h待试菌培养物大量穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，培养 1 4d观察结果，如为阴性应继续培养一下，作最终判定，变为 粉红色为阳性 。2011/12/28 13将待测菌种接在硝酸盐液体培养基中，置室温下培养， 1、 3、 5d取样测定。每株菌作复本，另两管作对照。培养液中加入格里氏试剂 A、 B液各一滴，如呈现 粉红色、玫瑰红色 ，表明硝酸盐还原 阳性 ，如无红色出现，则加 1，2滴二苯胺试剂，如呈 蓝色 ，表示培养液中仍有硝酸盐存在，硝酸盐还原属 阴性 ，若 不呈蓝色 ，表示硝酸盐和亚硝酸盐都已还原成其他物质，仍按 阳性 结果处理。f. 硝酸盐还原试验2011/12/28 14g. H2S的产生某些细菌能分解含硫化合物如胱氨酸、甲硫氨酸而产生硫化氢气体，若于培养基中加入柠檬酸铁铵或醋酸铵，则与硫化氢作用生成 硫化亚铁或硫化铅（黑色）沉淀 。h. 黑色素的产生将供试菌株接种在酪氨酸培养基斜面管上，培养 7 d 和 14 d 观察结果，培养基被染成 褐色或者黑色 即说明该菌产生黑色素。2011/12/28 15i. 碳源利用和氮源利用（本实验利用 BIOLOG板）碳源： D-葡萄糖，蔗糖， L-树胶醛糖， D-果糖， D-木糖，鼠李糖， I-肌醇，棉子糖， D-甘露醇，纤维素。不加碳源的基础培养基作为阴性对照。氮源 : KNO3， NaNO2，尿素， (NH4)2SO4，丝氨酸，烟酰胺，酪氨酸， DL-天冬氨酸， L-甲硫氨酸， DL-丙氨酸， L-精氨酸， L(+)-谷氨酸，甘氨酸， L-苯丙氨酸，腺嘌呤。不同氮源按 0.5% 的浓度加入，培 15天后，将各种氮源上的生长状况与不加氮源的基础培养基上的生长状况作比较。2011/12/28 16A 细胞壁化学组分B 磷酸类脂测定C 甲基萘醌测定D 脂肪酸测定2011/12/28 172.3.2 化学分类A.细胞壁化学组分放线菌的细胞壁主要成分为肽聚糖，根据肽聚糖分子中肽链第 3位氨基酸的种类，种间肽桥和邻近的四肽交联的位置来决定放线菌细胞壁型的划分。Lechevalier等（ 1976）根据放线菌细胞壁的化学组分和全细胞水解液糖型，将放线菌归为 9个主要类群和 4个糖型。2011/12/28 18胞壁 类 型 主要 组 成 代表属I L,L-DAP，甘氨酸 SterptomycesII Meso-DAP，甘氨酸 MicromonosporaIII Meso-DAP ActinomaduraIV Meso-DAP，阿拉伯糖，半乳糖 NocardiaV 赖 氨酸， 鸟 氨酸 ActinomycesVI 赖 氨酸（天冬氨酸，半乳糖） OerskoviaVII DAB，甘氨酸 AgromycesVIII 鸟 氨酸 BifidobacteriumIX Meso-DAP， 多种氨基酸 Mycoplana放线菌细胞壁的主要构成（ Lechevalier， 1976）2011/12/28 19糖 类 型 主要成分 代表属、种A 阿拉伯糖，半乳糖 NocardiaB 马 杜拉糖 ActinomaduraC 无特征性糖 StreptomycesD 木糖，阿拉伯糖 MicromonosporaE 半乳糖 Kutzneria viridogriseum放线菌全细胞的主要糖类型（ Lechevalier， 1976）2011/12/28 20全细胞 TLC分 析实验流程：全 细 胞糖分析菌体培养与收集细 胞水解（ 0.1ml 0.5mol/L HCl）点 样（ 0.6-0.8l水解液和 1%的 标 准糖液）层 析显 色（苯胺 邻 苯二甲酸 试剂）氨基酸分析菌体培养与收集细 胞水解（ 0.1ml 6mol/L HCl）点 样（氨基酸水解 样 品 0.4l和 0.01mol/L标 准氨基酸混合液 0.2l）层 析显 色（ 0.4%茚 三 酮试剂 ）2011/12/28 21磷酸类脂位于放线菌细胞膜上，属于极性脂。不同属菌的磷酸类脂组份是不同的，它是鉴别属的重要特征之一，是化学分类项目中不可缺少的分类指征。磷酸类脂的种类繁多，但用于分类的指征并不多。用于分类指征的磷酸类脂只有五种：磷脂酰乙醇胺（ phosphatidyl ethanolamine,PE）磷脂酰甲基乙醇胺（ phosphatidyl methyl ethanolamine,PME）磷脂酰胆碱（ phosphatidyl choline, PC）磷脂酰甘油（ phosphatidyl glycerol ,PG）含葡萄糖胺的未知结构磷酸类脂（ phospholipids of unknown structure containing glucosamine, GluNu）B. 磷酸类脂测定2011/12/28 22称取 1g湿菌体于带螺口的 40 ml离心管中。加入 15ml甲醇。100 水浴 10 min，自然冷却。 加入 10 ml氯仿和 6 ml 0.5%NaCl 。 用力摇匀 10 min，静止可看到分层。 8000 rpm，离心 10 min。到入分液漏斗静止分层，取下层。30-40 旋转蒸干。分两次各加入 200l氯仿 /甲醇（ 2:1）冲洗器壁。 液体移入 EP管（约 100-200l） ,8000 rpm，离心 10 min，去沉淀。4 保存备用。 细胞磷脂的提取2011/12/28 23点 样（ 距离底 边 2*2cm，点 样 10l，溶 剂 前沿 1cm）展 层（ 展 层 液：第一 层 ： 氯 仿 :甲醇 :水 =65:25:4第二 层 : 氯 仿 :甲醇 :乙酸 :水 =80:12:15:4 ）显 色（ 6种 显 色 剂 ）实验流程：2011/12/28 24C. 甲基萘醌测定2011/12/28 25大多数细菌含有甲基萘醌或泛醌，或两者均有。包括放线菌在内的革兰氏阳性细菌只含甲基萘醌。放线菌及有冠军的甲基萘醌异戊烯侧链长度和氢饱和度变化相当大，多为部分饱和，含有 7-12个异戊烯单位。放线菌目中不同菌属的甲基萘醌类型如下表所示。2011/12/28 26放线菌目中甲基萘醌类型类 型 萘醌 种 类Eubacteria（异戊 烯单 位无 氢 化） IaMK-7Bmk-9Mycobacterium（主要是 8或 9个异戊 烯单 位上被 2或 4个 氢 化）II aMK-8(H2)bMK-8(H4)cMK-9(H2)dMK-9(H4)Saccharomonospora（ 4氢 化的多 烯萘醌 ） IIIaMK-8(H4), MK-9(H4)bMK-9(H4),MK-10(H4)Streptomyces（具有同一 链长 ，但 氢饱 和度不同的 萘醌 ）IV aMK-9(H2), MK-9(H4),MK-9(H6)bMK-9(H4), MK-9(H6),MK-9(H8)cMK-10(H4),MK-9(H6)菌体的收集制备待测菌株用液体培养基培养，离心收集菌体，用蒸馏水洗涤两次，菌体于 -80 冷冻 3d，冷冻干燥机抽干菌体，冻干菌体 4 干燥器保存备用。醌的提取及纯化2011/12/28 27D. 脂肪酸测定放线菌细胞中脂肪酸的链长、双键位置和数量及取代基团具有分类学意义，是一项重要的分类特征。脂肪酸组份一般较为复杂，分别归属 3种类型：直链饱和与不饱和、分枝和复杂形式的脂肪酸。脂肪酸分析应在标准化的条件下进行，因为不同组分的相对含量因菌龄和培养条件的不同而异。脂肪酸定性分析结果限于属和属以上的分类；脂肪酸定量分析可为种和亚种分类提供有用的基本资料。2011/12/28 282.2.3 基因型分类A G+C% 含量分析B DNA