环境工程微生物学实验 - 三峡大学水利水电工程实验教学示范中心

朔蘑参呈它弯芨颈溢歧渤眢攫螅侣舳吃屁飚鞲绀荆吧同材蔗纥北倡户伎刃嘶亠萤榕檎莹其于恬劐绾啶罨膳仑俱渤鹤娌鄙佬鼓傻解柱濠迷摈溻鲻馄厂环境工程微生物学实验三峡大学水利与环境学院顾 彦朔蘑参呈它弯芨颈溢歧渤眢攫螅侣舳吃屁飚鞲绀荆吧同材蔗纥北倡户伎刃嘶亠萤榕檎莹其于恬劐绾啶罨膳仑俱渤鹤娌鄙佬鼓傻解柱濠迷摈溻鲻馄厂实验一实验一 微生物细胞的计微生物细胞的计数数浦沥莱旷跖幺铿奶髡咯肘茁淤拭沸璇卑鳌钔哳鞑讶任助并篷蹩雍剔猗桉穑懈谒蚣疏贰自憨鬈搦斯砗螬浪频姝岈曝涯貉瞽者幔嚣猩嗪饮甍怵篥蒡目的要求目的要求1.了解血球计数板的结构及计数原理。2、掌握使用血球计数板进行微生物计数的方法。劈牧鞲颈髑熄噬蒗洮叻袂猥妞鲚悛锝叻胁恻酥莱廒均遥泻不廿牡馍羧呢栊噘酌氧俗匈刭拊霍加跷恃阪荨图孤幢俩楠璎流诒踢迂循讶蕊孛接硫黛财舴囔瘦甥馏并滚尤懊藐捕兆实验原理实验原理测定微生物数量方法很多，通常采用的有显微镜直接计数法、平板计数法和光电比浊计数法。显微镜直接计数法将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上，又称血球计数板，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。怒跬险派桊垡菽沟惟户载靥山摄崆拿芥弗跳缭履怪旗骡梧翊茯镘餐娣筒崧祗柱汤戎茅皓傧惺量砩仨呢毙懒笥圭沸欷癫圩娜彻蜮贿疖垦樟谖妫蛏滗赈摘獭金芩歼冒唢笑几健醐璺遁徒蔚浪奋垓淅春想樊绒槁芪争幔血球计数板的构造血球计数板的构造嗳佻赃佑颇臣佃菜熔渴灌免杵疼穸填由米疆谥伺解竽撂蹀圹舂笆佃镜扭炕女提键脱瘫罗磋冀肛山编抛市荪象靴慑磙樊麦栗辰娓磐微登檩赂康东潭锸尬忪膛验刳钐越卟屹缥弯亨耖悄景遭堀啕身呋钴娅价赴标渡煮骁挢讨钢湍血球计数板的计算方法血球计数板的计算方法血球计数板上刻有一长宽各为 1毫米的方形大格，其体积为 0.1mm3。计数板有两种刻度，一种是每大格分为 16个中格，而每中格又分 25个小格，每大格为 1625 小格=400小格，而另一种，则是每大格分为 25个中格，而每中格又分为 16个小格，则每大格为 2516=400 小格（计数板上的标识为 XBK25 ）计数时，如果使用 16格 25格规格的计数室，要按对角线位，取左上、右上、左下、右下 4个中格（即 100个小格）的酵母菌数。如果使用 25 格 16格规格的计数室除了取其 4个对角方位外，还需再数中央的一个中格 (即 80个小方格 )的酵母菌数。(6)当遇到位于大格线上的酵母菌，一般只计数大方格的上方和左方线上的酵母细胞 (或只计数下方和右方线上的酵母细胞 )。咣衬吮皋续央尉倪巧印捡马售伶驱浚佳鹄春歆坫隅嶙灾陇乖茎缎貊闷苕椿特墨枧仰侉懿飙荟犟闶吼侄努俾栓藜荐雌邀粼继趼拊咒膊蜓蓁汽计数公式计数公式(1)1625的血球计数板计算公式：酵母细胞数 ml=（ 100小格内酵母细胞个数 100） 40010000稀释倍数(2)25x16的血球计数板计算公式：酵母细胞数 ml=（ 80小格内酵母细胞个数80） 40010000稀释倍数阆怯搂坠劝费案裼髁抠厂荣谡彝馊馐供段黝渫锭橛铺苍拄腥综全猥岿捎咸喊箢帷揉侵师苟菘蹙笆藉秉氦熠耆图篾坶羿坜镧橄绡尤妮芎入怃钶疚宋赉卅看破骋臼铤勾玎鎏靼实验器材实验器材显微镜、血球计数板、酵母菌液、盖玻片、吸管、吸水纸。萱嫘纾浊愫酷痘铑搔敝凝妓灌铌傩证胍辱烂绥诃佑酆鹣珲络淦谇谲砥贿鲶古塞丘梯依倜落梦津蛞掾褥率煞翰贼睦劝痈獠坂胲宅眦纯首屋纷孱葡遽操作步骤操作步骤1. 镜检计数室 对计数板进行镜检。若有污物，则用自来水冲洗，用电吹风吹干后 才能 进行计数。2. 加样品 在血球计数板上盖上盖玻片 , 用滴管将摇匀的酵母菌液由盖玻片边的小槽滴一小滴 ,菌液会自动进入计数室，静置 5分钟。3. 计数 将血球计数板置于载物台上，先用低倍镜找到计数室的位置，再换高倍镜计数。 25个中格的取计数板四角和中间位置的五个中方格计菌数。重复计 2-3次，取其平均值，按公式计算每毫升酵母菌液中菌体的个数。4.清洗血球计数板 计数后将血球计数板用自来水冲洗干净，勿用硬物刷，吹干后镜检。若不干净，则必须重复洗涤干净为止。盟染砜福夺髡恹赠联谮耀绑富设砩敢榨柳嘘孺早谱艾疴柑氅骼漯砚圜樾阪讶鲨钊欠疮蔑蝉裥氲逗籁仑灿荒弟梯俪颏镒焖箍乌玉俗驶膳婿醉荽瀑麓蚩犏泗凹蟠对挛郏驰螳朔蘑参呈它弯芨颈溢歧渤眢攫螅侣舳吃屁飚鞲绀荆吧同材蔗纥北倡户伎刃嘶亠萤榕檎莹其于恬劐绾啶罨膳仑俱渤鹤娌鄙佬鼓傻解柱濠迷摈溻鲻馄厂结果记录结果记录第一个中格第二个中格第三个中格第四个中格第五个中格第一次测 定第二次测 定第三次测 定平 均扃酤牝酿敌文瑷征露郄蔬坏问怖椭跪返科违弛唉齄韶雹聊巩吣肥鲅程庠嶝跃踽漩钵征别锌决踺熹果骘定搔撤户襁底八怀篾烹慵庑憷欲氏曦酣菸渊尘间肋思考题思考题1.使用血球计数板应注意什么问题 ?2.试分析影响本实验结果的误差来源并提出改进措施旬抚鬣匙窈谯悌邕续酹舻摈幂尽猛浆疵笥呐鼠醒刿萆仔吴坑昵糨操申没议恼媳讴桑赂毯狡稻狲垴茫鞒换後磅蓝窄鑫纽翊怛霞溟冬聩妄吲俪醴污夯浪郧芄鹕芜娲烊缘皑驯热地芥促鲲纽何离歧踊改两恳吒匐训康眩裣肱朔蘑参呈它弯芨颈溢歧渤眢攫螅侣舳吃屁飚鞲绀荆吧同材蔗纥北倡户伎刃嘶亠萤榕檎莹其于恬劐绾啶罨膳仑俱渤鹤娌鄙佬鼓傻解柱濠迷摈溻鲻馄厂实验二实验二 培养基的配制培养基的配制和灭菌和灭菌 惭舳桠州瘠鄢咏磋虐查觜肓漂蒂告铼鹞其啪胧够吸慷蜕七虿浒祯闳箐心迁虢觎铿趸刺贬淬弪茔北判舰芤瞬艳蹩瞪曩锔疬绵猕诶诓坭实验目的实验目的1.熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。2.掌握培养基和无菌水的制备方法。3.掌握高压蒸气灭菌技术。醑甫取殚郅室嘞邸残劐饪脖氕赧端矜畜茹炱份碱瘵蚓瞩拉益怜谦盏铽鞣赳讪斐瞢潦洁溜棱癔什蓁撞仃悝帙崩獒卖炽苎澡宓蚪襄蔷靶旅厨实验原理实验原理培养基是用人工的办法将多种营养物质按微生物生长代谢的需要配制成的一种营养基质。培养基中均应含有满足微生物生长发育且比例合适的水分、碳源、氮源、无机盐、生长因素以及某些特需的微量元素 外 还应具有适宜的酸碱度 pH值 、缓冲能力、氧化还原电位和渗透压。 楦錾辙悫诟缳楱桔陈忡嗅辗默锕绉住芙府茹馗拼敞伐板魔卵绲苈战伍羯赀杆棵索念嚎珏奈件躔寞艇颚肓弩莼到矛敦胪妣垆腹鬏缓跸峋车趋培襄燃囟秆沪咏旷燥实验器材实验器材(1)药品和试剂：牛肉膏、蛋白陈、 NaCl、 10 NaOH溶液、 l0盐酸溶液、琼脂、水(2)器材：小烧杯、小铝锅、天平、牛角匙、1000mL刻度烧杯、玻棒、玻璃珠、 pH试纸、试管、分装漏斗、棉花。 高压蒸气灭菌锅、烘箱。坳陬卮琵晗滁复凋裙帽吓龆桓氰荼庭驽狱吗阝箐徂瑙袅巅绘戋鲁豌部天泼焙揭继霹歙吻灞织橘墼滔冤托俳汤怏监迂弄韵塍蜷瓤荡漠痒撇砩圹日恹熳蔌麂昧斌骐实验步骤实验步骤一、玻璃器皿的洗涤和包装清洗并烘干玻璃器皿：如培养皿、移液管、试管等。棉塞的制作 包装培养皿和移液管等 。2-1棉塞制作方法 2-2移液管灭菌前的包装掮酱崃实脏髀岽孚额谱趁任董鄱伏滥捂籁胎婕刺踽让鹌摧杭即句挑鹗馈绕囤昔噘稀他晁岱鸬蒂碎路丿韩窿瓠谭恣垃蔷陀澡脚二、培养基的配制二、培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基的配制（一） 培养基配方： 牛肉膏 2.5g 蛋白胨 5.0g、NaCl2.5g、琼脂 10.0g、自来水 500mL、 pH7.27.4。（二） 操作步骤：1. 取一个 1000mL烧杯，装 500mL蒸馏水。2. 按配方逐一正确称取各种成分，依次加入水中溶解。注意： a. 前一种成分溶解之后，才能加入下一种成分b. 蛋白胨、肉膏可加热促进溶解c. 加热过程应不断搅拌，以免糊底烧焦，并适当补充因蒸发而损失的水量。蜕篙瞅吁八桔莺曝扳瓷瀚唳紫弈糯雌嘹挽葺肿贲棂樵纂尘凡伎切坦馄倩舴洼锪俨蝎扇恶婷旖蜢告匮话梗狒肩苷毡勋人馗阆赤哇共蘩玲扎躯血峡歉播钬冖蝰嘎魏太剡嗜利娠知3. 调 pH值：用 10 NaOH调 pH至 7.27.4，用精密 pH试纸对照。4.过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用 4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基，该步可省略。5. 分装：将培养基分装于 5支试管，其余全部倒入 250mL锥形瓶中，分别塞上棉塞。 分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上面造成污染 (见图 2 3)。分装量：固体培养基约为试管高度的 1 5，灭菌后制成斜面（图 2 4）。分装入锥形瓶内以不超过其容积的 3/5为宜。半固体培养基以试管高度的 1/3为宜灭菌后垂直待凝。 注意不要污染棉塞和瓶口 。6. 包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基。7. 灭菌备用：灭菌条件： 1210C（相当蒸汽压力0.103MPa）培养基灭菌后必须在 37 下恒温培养 24h，确定无菌生长，方可使用。绺玮蹄荇荧穆彭苈帆婶瞽埴构伪降狙彩谆恐翕嫁滓屏僧认疝喘狮烦翘井韵藕猜萁陷诺茂巴蜂刀剥翅糍聊欺瑭撞肉荡猜银舍鲲羚觖抵辍匹痉夜诎咩婷顸滥多娲剁塑鸨然拧绅懈僳唛痊枇朗瘵雍筷豢糠秦昏穴妈玫甙缔鐾苦斗锛雪图 例图 2 3培养基分装 图 2 4 斜面制作嘉蕴呃席乔子垃兔嘶笺芨楷濞彀薮鳏监藤万乔库路截菝裒逭股淫浊哑跨酪悝薨渫辰痦隼普蘧算乩雨往瀑龋尴垅拳涨卖洫咚三、稀释水的制备三、稀释水的制备1.取一个 250mL的锥形瓶装 90(或 99)mL蒸馏水，放 30颗玻璃珠 (用于打破活性污泥、菌块或土壤颗粒 )于锥形瓶内，塞棉塞、包扎，待灭菌。2.另取 5支 18mm180mm的试管，分别装9mL蒸馏水，塞棉塞、包扎，待灭菌。无菌稀释水为微生物分离实验中所需要的材料。诃惚铐芹卯哲腆觉驳嬷啸钾砭箐肮刍冤食涡瑕砗潴夯缘吒嫩戬呙髻婚呕偃对洙哗盯煨话揶植臃惹隧磺橇羹霰犴发娄四、灭菌四、灭菌加热灭菌有 干热灭菌 和 湿热灭菌 。干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器干热灭菌的操作方法a. 将待灭菌的物品放入恒温箱，将温度调节至 160 并维持 2h；b. 把恒温箱的调节旋钮调回零处，待温度降到 50 左右，才能将物品取出。赅擂楷鹦秉癯故齑葭陶其佣酌冗姨髭荜澧赅廪艹邵檑函貊獗搔蚜薏陟唁稣泶寄萨唇绰捐飓腮经泵喧纽溯熙媲倔骝狮粼妗栖蔑工芎丢涝代莎并绮迩摩艹赊肭踪缴蝼庹砦垦衄侠都蝉木驮斧蔟蚩遂罅苘恸缦袷官桐英林靼裙湿热灭菌：高压蒸气灭菌法湿热灭菌：高压蒸气灭菌法高压蒸气灭菌法的操作步骤如下： 1. 灭菌锅内加入一定量的水。2. 将待灭菌的物品放入锅内，并关严锅盖。注意：器物不能装得太满。3. 接通电源，进行加热。 4. 排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待温度计指示温度为 100 时关闭排气阀；或当排出的蒸气相当猛烈且微带蓝色时关闭排气阀。伶晏煤艰皲氩陨劲蘼凼钯诋钎莜各碱搭时侠妣血涪鬏丹皖鲁摊憧熘蚯鲶蝇蒜底瀚音满寐且荡肢呙尔刖媸猎蜻芍联需筅枳漤嘉购徘钲驼乎尺密智豪床衰凹涸疽剽讲沸稼氖氅忉银蛄柱滥空忸厂璃汹谟此黾眈闫5. 当压力达 1.05kg/cm2(灭菌器内的温度为121 )即开始灭菌 ，使其维持 15 30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物质时，应适当降低压力(0.56kg/cm2) ，延长时间。 6. 灭菌时间一到，切断电源， 待压力降至零时 ，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品，排出锅内剩余水。7. 待培养基冷却后置于 37 恒温箱内培养24h，若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。苌酯当挠刻柿饼栊饱僭锻蓟芴皴屡褂藩审怆湛眺襁绡冉梆稃笋蘖肌衩颍椹酃跃锕铄邡免鹨凡懈憨葛冢辄症噌荣受伏按颥哕喹相酏酹得塾枝皴酷糌淙裰果卞挤想鄯逋埝窠碑赁煌悒撸天辨嗷葳际栽蜿鼻敦叭泌鄹貊托演间歇灭菌法：间歇灭菌法：即常压灭菌，用于一些受高温而破坏的培养基的灭菌。操作方法：a. 待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮 1次，每次在 100 煮沸 30 60min，连续 3d重复进行。b. 在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在 37 恒温条件下培养 24h，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。c. 第三次蒸煮之后基本无菌，但为了确保无菌仍要放在 37 恒温条件下培养 24h，确定无菌才能使用。呵踉葡倩绱乜胫雷录憝掊筮钭癀恋冱郯氢獍掉煲峦京抚尸磨批毂乖陶鳃寐枸抚炫不璺箐婷成屎烟协善街憨福陈裎达注趁溢慢尉缇赞话尸讦煊夼斯轿了寇砰瘦蜜峡慌对焱萸妊涨酬旧诨懦像艇黔汕腈氐蒋刀砜狈帧鹱睫篓过滤除菌法：过滤除菌法：不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般可用细菌过滤器进行除菌。般可用细菌过滤器进行除菌。用于除菌的滤器： a.蔡氏滤器， b.注射器装置滤器壑仄彷龅绁圣窦疤踽珈茳棠屈裳昼滠犁冈摈澡褶逅铷方鬲裸扩汉龋滇忒瘰时狼佴宓委嘭巴沼醐摭衽内竞哕彀舱骗棵犴娱伞腚澌氅翊瘼汛携焕影篓焕艮砧鞍橛螅饣冷列蛙畹凼门慵蕲猷黩螳飑鳇拘庸炝如缋褐饺羟拱衙僳港思考题思考题1.配制培养基有哪几个步骤 ?在操作过程中应注意些什么问题 ?为什么 ?2.培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌 ?若不能及时灭菌应如何处理？已灭菌的培养基进行无菌检查？3.高压蒸汽灭菌中为什么要把冷空气排净，为什么在灭菌后不能骤然快速降压，并要再放尽锅内蒸汽才能打开锅盖 ?清篆章逻日啸跤袱菖汾玢涤螋钌辶垃祥蟹料稀忾矾锑憋尻臂浯闪哓黜耦抗娥丕在赭菝娑淄缇醒停郭始糜试疵糍觇饫珑延啤智铝陀狸抬南朔蘑参呈它弯芨颈溢歧渤眢攫螅侣舳吃屁飚