微生物的实验室培养2014上课

到目前为止， 几十项 Nobel生理学和医学奖，化学奖 都与微生物学有关微生物的类群 原生生物：原核生物:真菌 :病毒 :如酵母菌单细胞的动植物如草履虫、单细胞藻类等无 细胞结构真核细胞细菌、蓝藻 原核细胞课题 1 微生物的实验室培养1.提供营养和条件2.防止污染一 .培养基： 微生物生存的环境和营养物质1.基本成分：思考：微生物 “吃 ”什么 ？碳源、氮源、水、无机盐 碳源 无机碳源：有机碳源： CO2、 CO32-、 HCO3-牛肉膏、蛋白胨等自养微生物异养微生物 氮源 无机氮源：有机氮源： NH4 、 NO3-（为硝化细菌提供 N源和能源）牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等注：含 CHON的 有机物 是 异 养型微生物的 碳源 、 氮源 、 能源一 .培养基： 微生物生存的环境和营养物质1.基本成分： 碳源、氮源、水、无机盐2.特殊营养 ： 维生素、碱基等（生长因子）（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）3.pH、 氧气的需求：4.种类 ：固体培养基 液体培养基有 无 凝固剂琼脂分离 鉴定工业 生产化学成分：物理性质：天然培养基 合成培养基牛肉膏蛋白胨培养基 是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基 。1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O 定容至 1000mlNacl 5g蛋白胨 10g牛肉膏 5g琼脂 20.0g分析营养构成？5. 配制原则 目的明确： 营养全面、浓度适宜、比例恰当 适宜的 pH值：有机碳源异养型：根据微生物的 种类、培养目的 选择原料自养型： 不 加碳源加入缓冲剂细菌偏碱，真菌偏酸（ CO2碳源）生产 科研耐高温需保持干燥的 物品， 160 170 1 2小时接种环、接种针等 金属用具7075 、 30min 80 、 15min100 、 56min消毒 灭菌定义方法较为 温和 理化方法，杀死 部分有害菌体（ 不 包括芽孢、孢子）强烈 的理化方法，杀死 所有微生物（包括 芽孢、孢子 ）煮沸消毒法巴氏消毒法化学药剂紫外线灼烧灭菌干热灭菌酒精、氯气、石炭酸等 高压蒸汽灭菌培养基，100KPa、121 、 15 30min二 .无菌技术： 防止外来杂菌的污染1.消毒与灭菌：请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（ 1） 培养细菌用的培养基与培养皿（ 2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管（ 3） 实验操作者的双手2.无菌范围： 实验操作空间消毒操作者的手、衣着消毒实验用具灭菌实验操作过程二 .无菌技术： 防止外来杂菌的污染1.消毒与灭菌：酒精灯旁操作超净工作台有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的 休眠体 ，叫做芽孢。 芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸 3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的 生殖细胞 。能直接发育成新个体。 单个或少数菌体2.特征：大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。3.功能：1.定义：菌落鉴定菌种 的重要依据固体 培养基上大量繁殖 子细胞群体1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O 定容至 1000mlNacl 5g蛋白胨 10g牛肉膏 5g琼脂 20.0g三 .大肠杆菌的纯化培养 ： 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.计算： 培养基用量依配方计算各成分的用量2.称量：3.溶化：牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、称量纸 、少量水加热溶解 取纸 蛋白胨、 NaCl 琼脂 补水定容4.调 pH、 分装、封口：5.灭菌：6.倒平板：培养基、培养皿分散成单个细胞 ,形成单个菌落倒平板倒平板约 50防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基1.培养基灭菌后，需要冷却到 50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答： 可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又 可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染 。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此 最好不要用 这个平板培养微生物。二 .大肠杆菌的纯化培养 ： 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基纯化大肠杆菌： 平板划线法：菌种划 3个 平板1个 不划线1.纯化大肠杆菌的方法： 平板划线法 和稀释涂布平板法接种环防止划破培养基（重复实验）（空白对照）平板划线法平板划线法平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以 分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体 。1、为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物杀死 上次残留的菌种 ，保证使下一次划线时，菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线 ？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。6支 试管，分别加入 9ml无菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106 稀释涂布平板法 ：a.梯度稀释菌液 ：菌液微量 移液器浸 稀释涂布平板法 ：a.梯度稀释菌液 ：b.涂布平板 ：不超过 0.1ml各 梯度分别涂布 3个平板1个 不涂布作空白对照滴 灼涂稀释103倍稀释104倍稀释105倍稀释涂布法稀释涂布法稀释涂布法是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第 2步应如何进行无菌操作？应从操作的各个细节保证 “ 无菌 ” 。例如：酒精灯与培养皿的距离要合适、 吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。3平板划 线 法和稀 释 涂布平板法的比较优 点 缺点 适用范 围平板划 线分离法可以 观 察菌落特征， 对 混合菌 进行分离不能 计 数 适用于好氧菌稀 释 涂布平板法可以 计 数，可以观 察菌落特征吸收量 较 少、较 麻 烦 ，平板不干燥效果不好，容易蔓延适用于 厌 氧菌和兼性 厌 氧菌 平板划线法：二 .大肠杆菌的纯化培养 ： 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基纯化大肠杆菌：1.接种： 稀释涂布平板法 ：2.培养： 将 接种后 的培养基和一个 未接种 的培养基放入 37 恒温箱中培养 12h 24h后，观察并记录稀释103倍稀释104倍稀释105倍（三）菌种的保藏：1.临时保藏： 试管固体斜面培养基上，培养长成菌落4 冰箱保存2.长期保存：菌种易被污染、变异甘油管藏1ml甘油（灭菌） 1ml菌液 20搁置斜面四、课题成果评价 （一）培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温 1 2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。（二）接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。（三）是否进行了及时细致的观察与记录培养 12 h与 24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发