实验二植物胚性愈伤组织诱导、胚状体的分化与高再生能力基因型的筛选

实验二 植物胚性愈伤组织诱导、胚状体的分化与高再生能力基因型的筛选实验目的l 理解植物细胞全能性的概念及应用。l 了解并掌握植物体细胞胚胎发生的过程和途径。l 了解植物体细胞胚胎发生的影响因素。l 了解紫花苜蓿高胚状体发生基因型筛选的原理与方法。实验原理l 植物细胞全能性 (totipotent) ：在离体培养下，植物的体细胞或性细胞被诱导产生器官 分化 和 再生 ，成为具有与母体植株 相同遗传信息 的植株的能力。l 植物细胞全能性的相对性1. 不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的培养反应；2. 动、植物细胞全能性的表现程度存在明显差异。3. 细胞全能性并不意味着任何细胞均可以直接产生植物个体。细胞脱分化 （ dedifferentiation)是指失去已分化细胞的典型特征，或消除了细胞分工，使之回复到分生组织状态，或胚性细胞状态。l 离体条件下植物细胞的脱分化和再分化l 愈伤组织 (callus)：脱分化后的细胞，往往经过细胞分裂形成一团无特定结构和功能的松散的薄壁细胞团。草莓 烟草l 细胞再分化（ redifferentiation)：l 脱分化后的分生细胞（愈伤组织）在特定的条件下，重新恢复细胞分化能力，并经历器官发生形成单极性的芽或根， 或 经历胚胎发生形成双极性的胚状体，进一步发育成完整植物体的过程。l 极性：是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。在很多情况下，细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志。细胞全能性脱分化再分化 个体再生细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的，在大多数情况下，脱分化是细胞全能性表达的前提，再分化是细胞全能性表达的最终体现。细胞分裂细胞全能性与脱分化和再分化的关系植株再生 两种途径：l 器官发生途径 : 根芽器官直接分化形成植株l 体细胞胚胎发生途径 : 产生具有胚芽、胚根的胚状体结构再形成植株器官发生 植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根（adventitious roots）、不定芽（ adventitious shoots）等器官的过程。 通过器官发生形成再生植株有三种方式：先芽后根A BC D百脉根先根后芽在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株。植物体细胞胚胎发生l 胚状体：（ embryoid）亦称体细胞胚或体胚。在体外，由体细胞（非合子细胞）经胚胎发育产生的类似胚胎的结构。l 其发育过程与合子胚类似，经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷形胚及子叶胚等几个阶段。植物体细胞胚胎发生l 在其发生的最早阶段就具有两极性，即根端（胚根）和茎端（胚芽），并且与母体细胞或外植体的维管束无直接联系l 胚状体一开始就是一个完整植物的雏形，可通过根端或类似胚柄结构从外植体或愈伤组织中取得营养。l 很容易从愈伤组织的表面脱离下来，在适宜条件下长成一株植物。类似于动物胚胎早期的发育胚胎细胞发生发育早期 2次均等分裂胚结构形成体细胞胚胎发生途径 胚状体可从离体培养的各种外植体上直接或间接地发生，大致分为五种：l 直接从器官外植体上发生 (以叶片为例 ）l 愈伤组织发生l 悬浮培养细胞发生l 单倍体细胞发生l 原生质体发生体细胞胚胎发生途径 1： 叶片诱导阶段 胚胎发育阶段(兰草 ,Chen等 ,1999)兰草体细胞胚胎发生途径 2： 愈伤组织悬浮细胞体细胞胚发生过程愈伤组织 胚性愈伤组织 悬浮培养的胚性细胞团球形胚形成成熟子叶胚影响因子外因内因 遗传性状生理状态营养条件环境条件无机盐有机物激素天然复合物渗透压酸碱度湿度温度光照影响体细胞胚发生的因素高胚状体发生基因型筛选的原理：l 紫花苜蓿：异花授粉（虫媒花）， 2n=32从理论上讲每一个植株为一个基因型，将每一个植物的外植体分别培养，比较分析胚状体发生数目的差异，从中可挑选出胚状体发生能力高的基因型。实验材料与用品l 材料：烟草、百脉根l 用品：接种器械 、超净工作台、等l 培养基：添加不同有机物的培养基，重点观察有机物对胚状体形成的影响，观察不同外植体上胚状体的形成。实验步骤：l 愈伤组织及胚性愈伤组织的诱导取无菌苗下胚轴或子叶为外植体（切成 3-5mm），每瓶分两部分，每部分放一个植株来源的外植体，封口，培养。培养条件：光周期 16h/8h，光照强度 3000lux，温度 25-28.观察： 3-7d时观察不同有机物的培养基中愈伤组织启动的差异； 21-28d时观察每种培养基上外植体形成胚状体的差异和相同培养基上不同基因型植株形成胚状体的差异。l 胚状体分化与高胚状体发生基因型的筛选将不同植株上形成的胚状体转移到新鲜的l 21-28d后观察胚状体分化状况挑选高胚状体发生基因型，取分化成苗的基因型的叶柄转入新鲜的愈伤组织分化培养基中进行新一轮的选择。未生根的植株转入生根培养基中生根。实验步骤：实验结果与分析l 一些重要实验现象可用数码相机照相，存入电脑，保存电子照片。1、材料培养过程中实验现象的观察纪录培养材料培养基配方生 长 状 态7d 1