实验1大肠杆菌的培养和分离

实验 1：大肠杆菌的培养和分离微生物包括哪五类 ：病毒病毒细菌细菌放线菌放线菌真菌原生生物特点： 结构简单 ,形体微小 .通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构 .且体内一般不含有叶绿素 .不能进行光合作用 .原核生物界原生生物界真菌界病毒界一、基础知识：(一 )微生物大肠杆菌（ E.coli）分布：人和哺乳动物肠道，此外还广泛分布于水、 污水、土壤、谷类、乳制品等当中。大肠杆菌在人体的 _中一般对人体无害，但任何大肠杆菌如果进入 _都会对人体产生危害。大肠杆菌是 _工程中被广泛采用的工具。肠道泌尿系统基因革兰氏 _（填阴或阳）性菌阴代谢类型： 异养，兼性厌氧型生长适宜温度：质粒、 EcoR 限制酶、 E.coli-DNA连接酶、 受体细胞37 左右细菌的代谢类型 n自养型细菌n异养型细菌 :光合自养型 :化能自养型 :大部分腐生菌和寄生菌如蓝细菌如硝化细菌1、同化作用类型2、异化作用类型需氧型细菌厌氧型细菌兼性厌氧型细菌大多数细菌如破伤风杆菌如酵母菌、大肠杆菌。大肠杆菌属于异养、兼性厌氧型细菌大肠杆菌酵母菌 放线菌 霉菌菌落： 单个或少数细菌 在 固体培养基 上大量生长繁殖时，所形成的肉眼可见的具有一定形态结构的 子细胞群体 。不同微生物形成的菌落具有不同的特征， 是鉴定菌种的重要依据 。如菌落的大小、形状、边缘、光泽度、颜色、透明度等。菌落的概念白色或乳白色，光滑大肠杆菌菌落：有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做 芽孢 。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸 3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌 .一、基础知识：（二）培养基 培养基（培养液）是 由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养 液。（ 1）按物理状态分： 固体培养基 和 液体培养基、半固体培养基 。（ 2）按功能分： 选择培养基 和 鉴别培养基 。（ 3）按成分分： 天然培养基 和 合成培养基 。1.培养基的类型和用途液体培养基：表面生长 均匀混浊生长 沉淀生长固体培养基：菌落，菌苔半固体培养基：无动力 有动力 (弥散 )(是否运动 ) 选择培养基加入青霉素的培养基 :分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基 : 分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基 : 分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基 : 分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基 : 分离导入了目的基因的受体细胞加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶 核苷的培养基 :分离杂交瘤细胞天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点： 营养成分丰富，培养效果好缺点： 来源受限 ;成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析 ;易发生支原体污染 ;根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点： 标准化生产，组分和含量相对固定 ;成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。 合成培养基 : 天然培养基：血清中含有： 多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） 多种金属离子； 激素； 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 各种生长因子 转移蛋白 不明成分人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。培养基的用途液体培养基：增菌， 常用于发酵工业固体培养基： 增菌， 菌种保存及分离纯化、鉴定菌落、活菌计数等半固体培养基：动力检测，保种不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方调节 pH2、成分水、碳源、氮源、 无机盐、 生长因子(生长因子即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物 ,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶 )真菌： 5 6 细菌： 6.5 7.5 有时会加一定量的氯化钠以维持一定的渗透压1.无菌操作的概念 无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止 _污染的方法。四、无菌操作_必须无菌、_也必须要无菌、_时不能带入其他杂菌主要包括：杂菌2.消毒与灭菌 的概念及两者的区别 消毒： 使用 较温和理化因素 ，仅杀死物体表面或内部的 一部分 对人体有害的微生物的过程。 不能杀死芽孢和孢子。灭菌： 使用 强烈的理化因素 消灭物体内外 所有 微生物，包括芽孢和孢子。各种器具培养基转移菌种比较消毒与灭菌比较项理化因素的作用强 度消 灭 微生物的数量芽 孢 和孢 子能否被消灭消毒灭菌 较为温和部分生活状态的微生物 不能能全部微生物强烈高压蒸汽灭菌（湿热灭菌）洒精灯灼烧灭菌干热灭菌（ 1）灭菌方法：3、常用的灭菌和消毒的方法培养基、无菌水、各种耐高温的玻璃金属器具100kPa、 121 下维持 15-30min需要保持干燥耐高温的玻璃金属器皿160-170 下加热 1-2h接种环等金属器具1、 煮沸消毒法 :100 煮沸 5-6min2、巴氏消毒法： 70-75 下煮 30min或 80 下煮 15min3、化学药剂消毒法 :用 75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒 ;氯气消毒水源4、紫外线消毒(2)消毒的方法：3.常用的消毒与灭菌的方法请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（ 1） 培养细菌用的培养基与培养皿（ 2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管（ 3） 实验操作者的双手答：（ 1）、（ 2）需要灭菌；（ 3）需要消毒。（一）制备 LB培养基（通用的细菌培养基）1、配方：蛋白胨 0.5克，酵母提取物 0.25克，氯化钠 0.5克，水 50ml（配固体培养基再加琼脂 1克）溶解计算称量 调 pH 分装加塞，包扎2、流程二 操作步骤灭菌 倒平板 分装： 注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，因此在将培养基转移到三角瓶或试管中时必须用 _。 加塞 ：试管用塑料盖或 _；三角瓶口用 _或 _封口 ,再用 _或报纸封口。 包扎： 用 _或报纸三角漏斗棉花塞 封口膜6层纱布 牛皮纸牛皮纸高压蒸气灭菌法 灭菌1）加水： 2）装锅： 向外层锅内加入适量的水，加水的要求是 _.物品放置的要求 _：加盖：将盖上的 排气软管 插入内层灭菌桶的 _内。再以 _方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。不触及内胆整齐、稳定、留出空隙排气槽两两对称3）加热排气： 4）保温保压： 5）出锅： 打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的_。 _后，关上排气阀。当锅内压力升到 _kg/cm2时，控制热源，维持压力至 _min。切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力降至 _时，打开 _，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。冷空气 待冷空气完全排尽0115排气阀否则会因锅内压力较高，打开气阀后造成的压力差可能使容器内的培养基喷溅造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至使容器爆炸。灭菌后，通常将实验用具放入 6080 _中烘干，以除去灭菌时的水分，避免引起 _。烘箱污染倒平板 ：待培养基冷却至 _ 时，将 每只培养皿倒入 _ml未凝固的固体培养基，置于 _位置上，轻轻晃动使其均匀铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。 _备用。制斜面 ：将未凝固的固体培养基的试管 _放，冷却待凝使即成为斜面。10 12水平倒置斜 倒平板、制斜面操作平台 ：灭菌好的培养基和实验器具置于超净台上打开_和 _，灭菌 30min.过滤风紫外线超净台思考题：A、操作过程中避免带入杂菌的方法有哪些？1、灭菌后的培养基、器具置于超净台上，并打开超净台的紫外灯和过滤风，灭菌 30分钟。2、用镊子夹出洒精棉球擦拭桌面和实验者双手。3、整个操作在酒精灯火焰旁进行4、打开后或加塞前试管口、三角瓶口灼烧灭菌。B、培养基灭菌后，需要冷却到 60后才倒平板，你用什么办法来估计培养基的温度呢？可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。 思考题C、为何要将平板倒置？平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落培养基，造成污染。 D、在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。E、如何检查培养基是否受杂菌的污染？将未接种的培养基放在恒温箱中培养，若无菌落产生则未受杂菌污染。（二）液体培养基接种培养主要器具：操作方法： 先将接种环进行 _灭菌 , _后的接种环挑取少量菌种，放入三角瓶的液体培养基中，加塞。置于 _ 摇床振荡培养小时。无菌操作： 略摇床思考：如何冷却接种环？可通过接触