内含子的比较

内含子类型内含子类型 细胞内定位细胞内定位GU-AG,GC-AG,AU-AC 细胞核细胞核I 类类 细胞器，细菌，低等真核生物细胞核中细胞器，细菌，低等真核生物细胞核中II 类类 细胞器，细菌细胞器，细菌双内含子双内含子 细胞器细胞器tRNA前体中的内含子前体中的内含子 细胞核细胞核概念 : ： 1980年代初，发现原生动物四膜虫 (Tetruhymenu) 的 rRNA内含子能够自我剪接(self splicing)，这一类内含子后被称作 型内含子 .后来在酵母菌的线粒体 rRNA基因中也含有此类内含子 .发现过程 为 :1980年 ,科学工作者将四膜虫 rRNA基因克隆到质粒中，并与E.coli 的 RNA聚合酶一起保温，发现转录产物除了有约 400nt的rRNA内含子外，还有一些小片段。从凝胶中回收 rRNA前体，在 无蛋白质的条件下 保温培养，单一的 rRNA前体依然可形成片段更小的电泳条带，其中移动最快的是 39nt的条带，测序发现，它相当于 413nt的 rRNA内含子中的片段。将四膜虫 26S rRNA基因的一部分 (第 l个外显子 303bp + 完整的内含子 413bp + 第 2个外显子 624bp)克隆到含噬菌体 SP6启动子的载体内，再转录该重组质粒，将获得的产物与 GTP一起保温，可以得到剪接产物，但缺乏 GTP时无剪接反应，证明 rRNA前体的确可以进行有 GTP参与的自我剪接。 (1) I型内含子剪接的过程 I型内含子剪接的 第一次转酯 反应，是由一个游离的 鸟苷或鸟苷酸 (GMP, GDP或 GTP)启动的。鸟苷酸或鸟苷的 3-OH亲核攻击内含子 5-端剪接点的磷酸二酯键，将 G转移到内含子的 5-端，同时切割内含子与上游外显子之间的磷酸二酯键，在上游外显子末端产生新的 3-OH。在 第二次转酯反应 中，上游外显子 3-OH攻击内含子 3-端剪接点的磷酸二酯键，将上游外显子和下游外显子连接起来，并 释放线性的内含子。两次转酯反应是连续的，即外显子连接和线性内含子的释放同时进行。因此，实验不能得到游离的上游外显子和下游外显子 。第三次转酯反应 是线性内含子的 环化 ，发生在已切除的内含子片段中，内含子的 3-OH攻击其 5-端附近的第 15和第 16核苷酸之间的磷酸二酯键，从 5-端切除 15nt的片段，并形成 399nt的环状 RNA。环状 RNA随即被切割生成线状 RNA，由于切割位置与环化位置相同，生成的线状 RNA依然为399nt。接着，再从 5-端切去 4个核苷酸，最终产物是 395nt的线性 RNA，由于这一产物比最初释放的内含子 少 19个核苷酸 ，因而被称作 L19。 v (2) I型内含子的结构 I型内含子剪接的最重要特点是自我催化 (self-catalysis)， I型内含子的自我剪接活性依赖于 RNA分子中的 碱基配对 。通过比较不同的 I型内含子序列，发现其中有 9个主要的碱基配对区域，命名为 P1 P9，在 I型内含子中高度保守的双链结构有 3个，即 P1的内部引导序列 (internal guide sequence, IGS)， P4的保守短序列元件 P/Q，和 P7的保守短序列元件 S/R，其他配对区的序列因内含子不同而异。 I型内含子自我剪接所需的最小催化活性中心由 P3、 P4、 P6和P7组成。该结构包括由两个结构域构成的催化核心，每个结构域由两个碱基配对区域构成。包含上游外显子末端序列和内含子端 IGS的 P1，构成底物结合位点， IGS是内含子中能与外显子进行碱基配对的序列，这种配对使剪接位点暴露而易受攻击，同时使剪接反应具有专一性 (图 8-16)。 I型内含子的特征1.边界顺序为 5UG 3;2.具有 中部核心结构 （ Central core structure);3.内部引导顺序 (Internal guide seguence IGS);4.剪接通过转酯反应（ Transesterification).v 8.5.2.1 II型内含子的特点 II型内含子主要存在于某些真核生物的线粒体和叶绿体 rRNA基因中，也具有催化功能，能够完成 自我剪接 .几乎所有的细菌 II型内含子能够 编码逆转录酶 ，并可作为逆转录转座子，或逆转录转座子的衍生物高频率插入特定区域，或低频率插入其它区域。 II型内含子是由内含子靠近 3-端的腺苷酸 2-羟基攻击5-磷酸基启动剪接过程，经过两次转酯反应连接两个外显子，并切除形成 套索结构的内含子 (图 8-17)。 v II型内含子的 5-端和 3-端剪接位点序列为5GUGCGYnAG3 ，符合 GUAG 规则。 II型内含子的空间结构保守而复杂，其自我剪接的活性有赖于其二级结构和进一步折叠的构象，因此在细胞内的存在受到限制。在 II型内含子特有的二级结构中，有 6个茎环结构形成的结构域 (dl d6)，在空间上靠近的 d5和d6，构成催化作用的活性中心 (图 8-18)。 在 II型内含子剪接过程中，首先由内含子靠近 3-端 d6结构中的分支点保守序列上 A的 2-OH向 5-剪接位点的磷酸二酯键发动亲核攻击，形成外显子1的 3-OH，内含子 5-端的磷酸基与分支点 A的 2-OH基形成 2, 5-磷酸 二酯键 ，产生套索结构，完成 第一次转酯反应 。接着，外显子 1的 3-OH亲核攻击 3-剪接位点，切断 3-剪接位点的磷酸二酯键，并形成外显子 1与外显子 2之间的 3, 5-磷酸二酯键，完成 第二次转酯反应 。经过两次转酯反应，两个外显子被连接在一起，并释放含有套索结构的内含子 。 v II型内含子主要的转座事件是 归巢 (homing)，归巢的实质是以内含子 RNA作为模板， 将逆转录合成的 DNA插入靶位点 。逆转录反应由与 RNA内含子结合的 RT催化，属于靶位点为引物的逆转录 (target-primed reverse transcription)。如图 8-20所示，归巢反应开始于双链 DNA外显子连接点上 RNA内含子在靶位点的反拼接 (reverse splicing)插入，这一步由 RNA催化， RT协助，相当于由成熟酶协助的拼接反应的逆反应。随后， RT的 En结构域在下游 9 bp 10 bp的位置切开 DNA的另一条链，再由 RT催化，以被切开的 DNA链作为引物进行逆转录反应。最后，通过 DNA的修复合成和连接完成内含子的插入过程。 Splicing releases a mitochondrial group II intron in the form of a stable lariat. v 从内含子的剪接机制来看， I型内含子、 II型内含子和核 pre-mRNA剪接的 III型内含子是相似的，只有 tRNA的 IV型内含子剪接机制完全不同。v I型内含子剪接与核 Pre-mRNA剪接体切除内含子的主要区别是，剪接体内含子使用内含子自身的一个核苷酸，而 I型内含子的剪接反应使用外源核苷酸，即鸟苷酸或鸟苷，因此在剪接过程中不能形成套索结构。v III型内含子的剪接体内 snRNA的整体形态和 II型内含子自我剪接时的形态类似，特别是剪接体的 snRNA和 II型内含子的催化部位之间的结构和功能十分相似。可以认为，这些 snRNA可能来自早期自我剪接系统的 II型内含子I型内含子与 II型内含子都能够完成自我剪接，不像 III型内含子那样需要结构复杂的剪接体。正因为如此， I型内含子与 II型内含子剪接的效率和调控远远比不上 III型内含子。 I型内含子的剪接反应使用外源 鸟苷酸或鸟苷 ， II型内含子的转酯反应无需游离鸟苷酸或鸟苷的启动，由内含子 内部的腺苷酸 引起，也许 II型内含子剪接的效率和精确度比 I型内含子更好一些。 8.6.1 核酶的发现1982年 Cech等研究原生动物嗜热四膜虫 rRNA的转录后加工，发现 rRNA的前体可以在鸟苷与镁离子存在下切除自身的内含子，将两个外显子拼接为成熟的 rRNA分子，该反应不需要任何蛋白质类型的酶参与，因此Cech认为该 rRNA前体具有催化功能，并将其命名为 核酶 (ribozyme).Cech和 Altman因发现Ribozyme而获得 1989年度诺贝尔化学奖。1985年 Cech等通过进一步研究，从切除的内含子中分离得到 L19RNA，可参与如转核苷酸反应、水解反应、转磷酸反应等。 L19RNA催化的转核苷酸反应如图 8-21所示，可以看出，L19RNA既可从寡聚 C切除核苷酸 (图 8-21 和 )，也可在寡聚 C上添加核苷酸 (图 8-21 和 )，其催化过程具备酶的所有基本特征。核酶作用的特点：1，化学本质 RNA2，底物 RNA 肽键 -葡聚糖分子酶3，反应特异性4，催化效率低5，产物Reactions catalyzed by RNA have the same features as those catalyzed by proteins, although the rate is slower. The Km gives the concentration of substrate required for half-maximum velocity; this is an inverse measure of the affinity of the enzyme for substrate. The turnover number gives the number of substrate molecules transformed in unit time by a single catalytic site.核酶的分类8.6.3 核酶的结构核酶的催化功能与其空间结构密切相关，已知有多种不同结构的核酶。例如， I型和 II型自我剪接内含子、锤头型、 RNaseP的 Ml RNA、发夹型、丁型肝炎病毒 (hepatitis delta virus, HDV)的基因组和反基因组等。 锤头型、发夹型和 HDV正负链核酶 均能促使自身或底物 RNA裂解，产生 2, 3-环磷酸酯和 5-OH锤头结构 (hammerhead structure)。锤头结构包含 3个茎环区以及 13个保守核苷酸构成的催化中心，可以由一条 RNA链回折形成 (图 8-22a)，也可由底物链和催化链共同构成 (图 8-22b)，两种形式的锤头结构都可构成如图 8-22c所示的空间结构，即酶的活性中心。事实上无论自我剪切型的核酶，