血红蛋白电泳的意义和判断 ppt课件

12目的 血红蛋白结构和功能的回顾 Sebia CAPILLARYS 2 / Minicap血红蛋白检测说明 血红蛋白临床结果说明3血红蛋白的结构血红蛋白分子是由 4条多肽链 (2对 )和 4个可以结合铁和氧气的血红素. Normal hemoglobins, contain alpha, beta, delta, and gamma globin chains.三维结构 4 亚单位 2 alpha链 2 alpha genes 3 非 alpha链 : beta, delta, gamma 1 gene , 1 gene , 2 g genes4正常结果Hb A: 22Hb F: 2g2Hb A2:22 +-琼脂糖凝胶Hydrasys (Sebia)碱性缓冲液成人 新生儿5血红蛋白遗传病类型(HEMOGLOBINOPATHIES) ? 血红蛋白疾病 血红蛋白性质变化 : 血红蛋白分子病 结构异常 , 一个或数个氨基酸变异或缺失 , 都将会导致血红蛋白分子的电性发生改变 常见血红蛋白变异体 -globin : S C DPunjab E 血红蛋白含量变化 : 地中海贫血 合成或合成调控异常 : globin Thalassemias globin Thalassemias 合并型 : 血红蛋白分子病 Hemoglobinopathies /地贫 Thalassemias6血红蛋白遗传病遗传性疾病基因学图谱正常基因 异常基因7异常血红蛋白类型 目前 , 已经证实的有超过 1000 种以上的变异体 (, , g and ) 大部分变异体出现频率较低 , 并且没有明显临床症状 4种主要变异体 (Hb S, Hb C, Hb E and Hb DPunjab)出现频率较高 ( 特定人群 ) 携带者会出现健康问题 儿童可能在出生时即伴随有严重症状8血红蛋白疾病的区域分布图血红蛋白疾病的区域分布图Thalassemias9常 见 与地中海区域 : 意大利 , 西班牙 ,希腊 , 近 东 地区 , 非洲北部 .同 样 常 见 于 东 南 亚 : 泰国 ,印度 , 越南 ,中国 , 印尼 .o 临床症状* Beta 地贫重症型 - 严重贫血 (需要长期输血治疗 )* Beta 地贫中间型* Beta 地贫轻微型 - 无临床症状Beta 地中海贫血o 常见区域o 没有 Beta链合成+ 合成能力下降10Alpha 地中海贫血o 临床症状 : 根据 Alpha基因的表达状态 , 有 4个不同程度的 Alpha地贫症状* 1 个基因表达沉默 : 静止型 (非常难检测到 , 在出生会测到 Hb Barts 1-2% )* 2 个基因表达沉默 : 轻型 alpha地贫 ,在出生会测到 Barts 2-10%* 3 个基因表达沉默 : 血红蛋白 Hb H病 , 出生时出现 2-30% Barts, 儿童 -成人出现 10-15% Hb H* 4 个基因表达沉默 : Hb Barts胎儿水肿综合征 (死胎 ) o常见区域常见与远东地区 ,非洲和地中海区国家11其他特征 Hb H Hb A2 Hb F 贫血 小红细胞 靶细胞 异常出生时少量的 (2%) Hb Barts0 正常 正常 0 0 0 一条链缺失出身时 Hb Barts (5%)0 正常或减 少 正常 0 0 0 2条链缺失不稳定血红蛋白溶血性贫血 (Hb H)10-15% 减少 也许增加 轻微的到 严重的 + + 3条链缺失胎儿水肿综合症 (hydrops fetalis)0 0 100 % Hb Barts 严重的 - - 4条链缺失12基因型 诊 断 血常 规 临 床症状 检测结 果/ 无 Hb A : NHbA2 : N (2-3.5%)-/ -Thalassaemia 2 杂 合体 (静止型 )轻 微小 红细 胞症MCV : 75-80fLMCH: 20-24无 Hb A and HbA2: NHb Barts 0-3% at birthConfirmation by molecular biology-/- -Thalassaemia 2 纯 合体小 红细 胞症血 红 蛋白减少Hb: 11-12 g/dL无明 显临 床症状 Hb A and HbA2: NHb Barts 2-8% at birth- -/ -Thalassaemia 1 杂 合体MCV: 65-75 MCH: 20-24需要分析序列分析或 DNA序列分析 - -/- HbH 小 红细 胞症血 红 蛋白减少Hb: 8-11 g/dLMCV : 55-65 MCH: 20-24出 现 溶血脾 脏肿 大HbA2 N or Hb Barts 5%Hb H 10-20%- -/- - -Thalassaemia 1 纯 合体 (死胎 )严 重 贫 血 水 肿 胎Hb: 8-11 g/dLMCV 100-110 MCH 无法存活死胎Absence of HbA and HbFHb Barts 80-100%Hb Portland 5%13镰刀 型 红细胞血症变异体出现在 6 GAG (谷氨酸 ) GTG (缬氨酸 )N SS ASabnormal gene normal gene NHbSASNHbAHbSSSChromosomes 162 12 1HomozygoteChromosomes 11Htrozygote AgAgGgGg AgAgGgGgHeterozygote14C型血红蛋白分子病变异体位置 :AA 6: GAG (谷氨酸 ) AAG (Lys)HbAHeterozygote ACHbCNHbASC CompoundheterozygotyHbCNHbSHtrozygote compositeACSCChromosomes 162 12 1HomozygoteChromosomes 11Htrozygote AgAgGgGg AgAgGgGgSC heterozygote compoundHeterozygote15D型血红蛋白分子病常见区域 :常见于印度 .特点 : 变异体位置 121 Glu (谷氨酸 ,负电荷 ) Gln (谷氨 酰 胺 , 不 带电 荷 ) (D- Los Angeles = D-Punjab)(6 different Hb D according to the position of the mutation)碱性 缓 冲液中 : 电 荷下降 M电泳速度变度变慢 ,靠近 Hb S临床症状 :基因杂合体 :无症状无症状 (仅在电泳中发现仅在电泳中发现 D区带区带 )Hb A fraction: 65 70 %Hb D fraction: 30 35 %基因纯合体 :轻微贫血Hb A fraction: absenceHb D fraction: 100 %16E型血红蛋白分子病常见区域 :常见与东南亚地区 .特点 : 变异位点 26 Glu (谷氨酸 ,负电荷 ) Lys (赖 氨酸 ,正 电 荷 )碱性 缓 冲液 : 总 体 带电 荷下降 凝胶电泳中 ,出现在 HbC附近临床症状 :杂合体 :无症状无症状Hb A fraction: 65 70 %Hb E fraction: 30 35 %基因纯合体 :轻微贫血Hb A fraction: absenceHb E fraction: 100 %17下列情况下 ,需要进行血红蛋白检测 临床和遗传问题 (产前诊断 ) 贫血 ,小红细胞症 新生儿筛查 对来自地贫高发区人口 ,进行筛查 对诊断有帮助的其他信息 患者临床症状 ,年龄 ,籍贯和其他相关的背景(输血记录 ) 血液全套检测 , 网状细胞级别和进行细胞形态镜检 Hb电泳 (EDTA抗凝管 ) 离子平衡和溶血情况18血红蛋白检测的几种方法 目前 , 血红蛋白检测步骤如下 :- 电泳法对 Hb进行检测或者使用等电聚焦电泳法- 使用 HPLC法进行确认 .1920凝胶电泳结果识别表 21 在 pH梯度的凝胶片上 , 根据蛋白不同的等电点 ,对蛋白进行分离 Hb电泳位置取决于缓冲液 PH值 蛋白电泳至其等电点位置后 ,停止泳动 At pI=pH, Hb does not have a net charge and stops migrating 电泳分离效果好 , 但时间长 .需要经验丰富才能获得良好结果及进行结果判断等电聚焦电泳法 介于普通电泳和等电聚焦电泳之间的新方法 :- 通过毛细管电泳法 , 即可以获得与 IEF方法一样的分辨率 ,同时检测结果量值 Hb A2/Hb F同样精确 .- 出现异常变异体后 :使用下列方法确认 :* ITANO test (solubility test)* HPLC液相色谱* Genotyping基因筛查22Capillarys 2Minicap全自动毛细管电泳法进行血红蛋白检测全自动毛细管电泳法进行血红蛋白检测 Capillarys 2 / Minicap23毛 细 管 电 泳法原理 Peltier温控 桥Anode +Cathode -检测器 氘光灯电泳电泳高电压高电压24此时此时 ,电渗力电渗力 (EOF)远远强于电场力远远强于电场力 .因此因此 ,蛋白被动从正极向负极端移动蛋白被动从正极向负极端移动 .正电极正电极 +EOF负电极负电极-Electro migration蛋白电泳蛋白电泳DETECTION INJECTION带正电荷的缓冲液带正电荷的缓冲液毛细管壁负离子鞘毛细管壁负离子鞘25Capillarys/Minicap血红蛋白电泳 血红蛋白条带 ,在电渗力的作用下 ,8分钟即完成电泳过程 , 然后 ,在 415nm紫外光下被检测并显示出来 . 正常质控品 必须在每天检测前使用 Capillarys :- 检测速度 : 40 样品 /小时- 试管架 1 至 7号位放置样品 , 8号位放 4ml溶血素 Minicap :- 检测速度 : 10 样品 /小时- 试管架 1 至 26号位放置样品 , 27号位放溶血素 (8个样品消耗 5ml溶血素 )26Capillarys/Minicap血红蛋白检测标本要求 抗凝管采血 (EDTA, heparin, citrate). 如果需要对输血患者采血 , 需要在输血前采集血液 . 使用去除血浆后的红细胞 (隔夜或 5000 rpm,5分钟离心后样品 ) + 4C以上 , 标本最多存放 7天 . 需要长期存放 , 可以洗涤红细胞后 ,放置于 -80C (可存放至少 3个月 ) 27Capillarys Minicap 血红蛋白条带识别表Capillarys/Minicap区带识别表区带识别表Z 15 : Hb HZ 14 : /Z 13 : Hb-J Rovigo, Hb N-Baltimore, J-KaoshiungZ 12 : Hb Barts, Hb Providence, Hb J-Mexico, Hb J-Baltimore.Z 11 : Hb Kaoshiung(New York),denaturated Hb AZ 10 : Hb Hope, Hb M-IwateZ 9 : Hb A, Hb Camperdown, Hb Phnom PenhZ 8 : Acetylated Hb F, Hb Altanta, Hb Athens-GAZ 7 : Hb F, denaturated Hb S, Hb Porto-Allegre Z 6 : Hb D-Punjab, Hb Philadelphia, Hb Korle-Bu, Hb Lepore,Hb Kln,denaturated Hb E.Z 5 : Hb S, Hb Hasharon, Hb Handsworth, dena