实验二：叶绿体的分离与荧光观察

实验二叶绿体的分离与荧光观察 细胞生物学实验细胞生物学实验实验目的v1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。v2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。细胞生物学实验实验原理细胞器分离的过程包括两个主要阶段： 破碎细胞 和 细胞组分的分离在等渗溶液中进行组织匀浆、分离叶绿体的分离采用 差速离心 或密度梯度离心法进行利用荧光显微镜观察叶绿体的 自发荧光 和间接荧光（次生 /诱发荧光）常用的细胞破碎方法方法技 术 原理 效果成本 举 例机械法匀 浆 法 细 胞被 搅 拌器劈碎或受剪切力而破碎适中 适中 动 植物 组织 或 细 胞研磨法 细 胞被研磨物磨碎 适中 便宜 植物 组织超声波法 用超声波的空穴作用使 细 胞破碎剧 烈 昂 贵 细 胞 悬 浮液小 规 模 处 理珠磨破碎法 细 胞被玻璃珠或 铁 珠捣 碎剧 烈 便宜 细 胞 悬 浮液和植物 细 胞大 规 模 处 理化学法渗透冲 击 渗透 压 破坏 细 胞 温和 便宜 血 红细 胞的破坏酶 消化法 细 胞壁或 细 胞膜被消化，使 细 胞破碎温和 昂 贵 动 植物 细 胞增溶法 表面活性 剂 溶解 细 胞膜温和 适中 破碎大 肠 杆菌脂溶法 有机溶 剂 溶解 细 胞壁 适中 便宜 甲苯破碎酵母 细 胞碱 处 理法 碱的皂化作用使 细 胞壁溶解剧 烈 便宜 破碎大 肠 杆菌细胞生物学实验离心分离技术离心 是 分离细胞组分和生物 大 分子最常用的分离方法，因为不同的细胞器和分子有不同的体积和密度，可在不同离心力 不同介质 沉降分离。分离各种细胞组分的方法主要有：差速离心 密度梯度离心 l速率 -区带梯度离心 l等密度离心细胞生物学实验差速离心 主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。 差速离心的分辨率不高，沉降系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取 细胞生物学实验密度梯度离心用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞匀浆 液 混悬或置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞 器 分层、分 离的方法。这类分离又可分为 速 率 -区带梯度离心 和等密度 梯度离心 两种。优点是一次离心可 分离 提纯样品中几种组份，用于较精细的分离。细胞生物学实验速 率 -区带梯度离心 和 等密度 梯度离心原理： 根据分离的粒子在梯度液中 沉降速度的不同沉降速度的不同 ， 通过离心力场的作用，使不同的颗粒在密度梯度层内形成一系列区带，从而达到彼此分离的方法。A、 速率 -区带梯度离心流程图B、 等密度梯度离心流程图原理： 根据不同颗粒在密度梯度介质中存在着 浮力密度差浮力密度差 ，在离心力场作用下，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置上形成区带，从而使不同浮力密度的颗粒得到分离的方法。 两种密度梯度离心方法的异同特 点 速 率 -区 带 梯度离心 等密度离心分离方法的主要依据 主要 依赖 分离的粒子在梯度液中 沉降速度的不同沉降速度的不同依赖于样品颗粒的不同密度来进行离心分离的 介质密度梯度选择 最大密度必须小于样品中粒子的最小密度；梯度平缓覆盖了待分离物质的密度；梯度陡度较高 离心介质的主要作用 减缓颗粒扩散速度 阻止颗粒移动；筛选与分离颗粒分辨率范围 沉降系数相差 20%的物质 颗粒密度差异大于 1% 离心后区带形成位置 易变 (样品易扩散） 不变（样品不扩散）影响样品区带形成的主要因素 离心时间（过长或过短都不利）颗粒样品密度一般操作方法 介质梯度应预先形成 ，离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心后形成区带。 介质梯度不需预先制备 ，离心时把密度均一的介质液和样品混合后装入离心管， 通过离心自形成梯度 ，让颗粒在梯度中进行再分配。常用介质 蔗糖 、甘油 蔗糖 、甘油、 CsCl、 硫酸铯、溴化铯、三碘苯衍生物等。 表 1:各种亚细胞构造在 不同的离心介质 中分离所需的 离心力与时间结结 构构 差速离心差速离心(在在 0.25M蔗糖溶液中蔗糖溶液中 )速率速率 -区区 带带 梯度离心梯度离心(5 50%蔗糖蔗糖 )等密度离心等密度离心(其他介其他介 质质 ,如如 CsCl等等 )细 胞核 800-1000g 10min 500g 10min 4000g 60min线 粒体 10,000g20min 5000g 10min 80000g100min溶 酶 体 10,000g20min 5000g 10min 80000g100min质 膜 (大片 ) 100,000g15min 100,000g100min 150,000g600min内 质 网片段 150,000g40min 1000g20min 100,000g200min微粒体 100,000g60min 10,000g30min 100,000g360min小 颗 粒 100,000g60min细胞生物学实验各种细胞器、大分子和病毒的 密度 及相应的 沉降系数图 :各种细胞器、大分子和病毒的密度及相应的 沉降系数根据 1924年 Svedberg（ 离心法创始人 -瑞典蛋白质化学家）对沉降系数下的定义： 颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。 以每单位重力的沉降时间表示，并且通常为 120010-13秒范围， 10-13这个因子叫做沉降单位 S,即 1S=10-13秒看图思考： 要将细胞匀浆液中的得到更纯的分离，选用哪种离心方法较好？(线粒体 :1.18g/ml、 溶酶体 :1.12g/ml、 微体:1.23g/ml)细胞生物学实验离心力与离心机转速转换公式：图 2:离心力与离心机转数的转换列线图RCF 1.11810-5r(n) (g)式中 ,RCF表示相对离心力 ,单位是重力加速度 g（ 980厘米 /秒 2） , (g)表示 重力加速度的倍数 ,r 为离心转子的半径距离，指离心管的重心至转轴中心间的距离，单位为厘米；n为转子每分钟的转数（ rpm）。 为了便于进行转速和相对离心力之间的换算，人们在此公式的基础上制作了离心力的列线图。见图 2. 先在离心机半径标尺上取 已知的离心半径 和在转速标尺上取 已知的转速， 然后在这两点间取一条直线，与中间 RCF标尺上的交叉点，即为相应的相对离心力数值， 也是文献中常用的 g。 r=8cmn=15,000rpmRCF20,000g细胞生物学实验荧光荧光显微镜观察 荧光现象：某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为 荧光 。若停止供能，荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光 ,称为 自发荧光 。 如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，称为 间接荧光 。如叶绿体吸附吖啶橙 后可发橘红色荧光。1.两组光源 :透射照明光源 (卤素灯 )； 荧光光源 (超高压直流汞灯或氙灯)；2.有特殊的滤光片 :激发激发滤色片和阻断滤片滤色片和阻断滤片3.激发光波长： 较短，因此，分辨力高于普通显微镜；4.荧光光源 照明方式：通常为落射式。紫外光 (UV)： 激发光谱区域： 330-400nm;紫光 (V)： 激发光谱区域： 395-415nm;蓝光 (B)： 激发光谱区域： 420-485nm;绿光 (G)： 激发光谱区域： 460-550nm ；荧光显微镜的 特点：图：落射式荧光显微镜的光路细胞生物学实验荧光染料 :吖啶橙 (acridine orange )吖啶橙是一种与 DNA和 RNA都能结合的荧光染料在 紫外光或蓝光 (330 485nm)激发下， DNA可被激发出 530nm的荧光发射峰 (细胞核发 亮 绿色荧光 )， RNA可被激发出 640nm的荧光发射峰 (核仁和胞质 RNA发 桔红色荧光 )。产生两种不同荧光是由于 吖啶橙 与双链 DNA 和单链DNA或 RNA的 结合方式和结合量不同 而决定的。 DNA是高度聚合物，它与 DNA结合是潜入双链之间，结合量相对少；而与单链 DNA或 RNA的结合则由静电吸引堆积在磷酸根上，结合量相对多些。我们推测，叶绿体的次生荧光的来由，大部分来自叶绿体的吸附作用，极少部分来自叶绿体中的 RNA.加入吖啶橙后叶绿体的 自发荧光 （火红色）消失了？原因：是荧光淬灭现象所致。吖啶橙是一种 芳香杂环阳离子型 染料，可透过细胞膜，因此而推测吖啶橙 阳离子 是进入叶绿体膜内通过影响叶绿素分子的结构或所处的化学环境使 自发荧光淬灭 的。荧光淬灭 ：在产生荧光的物质的溶液中加入盐等物质会使溶液的吸光度下降而荧光强度变小的现象。荧光淬灭现象产生原因 ：分子结构和化学环境是影响物质发射荧光和荧光强度的重要因素（ pH、温度、光、淬灭剂 ） .细胞生物学实验实验用品材料 ： 菠菜叶片试剂 ： 蒸馏水， 0.35mol/L氯化钠溶液， 0.01%吖啶橙(AO) 仪 器 ：普通离心机， 组织捣 碎机，天平， 荧 光 显 微 镜， 显 微 镜 ， 镊 子，培养皿， 纸 ，移液管，滴管， 烧 杯，无 荧 光 载 片，盖玻片，离心管 ,吸水纸等配制方法： 称取 0.1g吖啶橙加蒸馏水 100ml做干液，放冰箱备用，临用前取 1ml干液加 1/15mol/L磷酸缓冲液（pH4.8） 9ml。细胞生物学实验菠菜叶片 (去叶脉 )3g 0.35mol/L氯化钠 15ml 研磨 (冰浴 ) 匀浆过滤 (2层尼龙网 ) 滤液在 1000rpm离心2min 弃沉淀，上清液 3000rpm离心 5min 去上清液 沉淀为叶绿体 (混有部分细胞核 )，用 0.35mol/L氯化钠溶液悬浮 滴片观察取叶绿体悬液 1滴置于载玻片上，加盖玻片后用分别用 普通光学显微镜观察叶绿体的形态结构 和 荧光显微镜观察自发荧光将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上 ,再滴加 1滴 0.01%吖啶橙荧光染料 ，盖上无荧光的盖玻片 ,使用 荧光显微镜 观察 间接荧光 取叶表皮临时装片荧光染色观察 实验步骤细胞生物学实验实验结果普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄型，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色颗粒，即基粒。荧光显微镜下，选用 蓝色激发滤光片 ，叶绿体自发荧光为火红色，间接荧光为桔红色。细胞核呈黄绿色。图： 叶绿体 自 发荧光 为 火红色细胞生物学实验细胞生物学实验叶绿体的分离应在等渗溶液 (0.35mol/L氯化钠 )中进行 ,以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。分离过程最好在 05 的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。离心机使用：离心管要平衡荧光显微镜使用 荧光显微镜检要在光线尽量暗的环境下进行 使用荧光显微镜时要注意不要直接观察激发光源，保护眼睛 凡是荧光染料都有一定毒性，请做好防护 利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等 在荧光观察时应抓紧时间 ,有必要时立即拍照。 在制作