“shRNA”原理及设计

shRNA 原理及设计RNAi 概述：RNA 干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链 RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源 mRNA 高效特异性降解的现象。简单的说是指一种分子生物学上由双链 RNA 诱发的基因沉默现象。当细胞中导入与内源性 mRNA 编码区同源的双链 RNA 时，该 mRNA 发生降解而导致基因表达沉默， 是 一 种特 异 性 的 转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing and transgene silencing)。由于RNAi 具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。RNAi 技术可广泛应用到包括功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。RNAi 基本原理示意图：RNAi 类别：1、siRNA 合成：原理：在 RNAi 效应阶段，siRNA 双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA 诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC） 。激活的 RISC 通过碱基配对定位到同源 mRNA 转录本上，并在距离 siRNA3端 12 个碱基的位置切割 mRNA。化学合成的 siRNA 具有操作简便、转染效率高、对细胞的或者组织的毒副作用小、可大规模制备等优点，特别适用于基因靶位点不确定情况下，进行 siRNA 有效片段的筛选。2、microRNA 干扰载体构建：原理：载体采用 Pol II 启动子表达人工设计的微小 RNA (miRNA), 后者从长的转录本被加工，进而导致特异性的 mRNA 的降解。3、shRNA 干扰载体构建： 短发卡 RNA (shRNA) 是可以克隆到表达载体并表达短的干扰RNA (siRNA, 19-21 个核苷酸的 RNA 双链)的 DNA 分子。我们可根据靶标设计短发卡RNA (shRNA)序列并将其克隆到特定载体上。4、慢病毒 RNAi：原理：慢病毒是逆转录病毒的一种，具有逆转录病毒的基本结构，但也有不同于逆转录病毒的组份和特性，作为基因治疗载体发展起来，最近已用于转基因动物制备。利用慢病毒构建的 shRNA/miRNA 载体，与化学合成的 siRNA 和基于瞬时表达载体构建的 shRNA 相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，lentivirusshRNA/miRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。5、腺病毒 RNAi：原理：腺病毒（adenovirus，AV）是一种没有包膜的线状双链 DNA，它能感染分裂细胞和非分裂细胞，在核内以神经元细胞的形式复制，存在多种 AV 血清型。到目前为止，构建的绝大多数载体都是基于血清型 2 和 5，通过转基因的方法取代 E1 或E3 基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在表达高水平 E1 和 E3 基因的细胞中复制，因此适合应用于治疗的高效控制系统。腺病毒载体能够高效传递和表达基因的能力（尤其是在体外） ，由于具有宿主范围广，对人致病性低；在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因；能有效进行增殖，滴度高；与人类基因同源；不整合到染色体中，无插入致突变性。对于难转染的细胞，如原代或非分裂细胞，采用病毒递送 miRNA/shRNA 的方式是非常有效的选择。几个概念的区分：shRNAs (RNA-Short hairpin RNAs)：即短发夹 RNA，是设计为能够形成发夹结构的非编码小 RNA 分子，可通过 RNA 干扰来抑制基因的表达。Thomas Rosenquist 和 Greg Hannon 小组联合研究了在哺乳动物种系细胞中 shRNAs 的转移导致基因长时间稳定沉默的机制。microRNA（ miRNA，微小 RNA）是由内源性发夹（hairpin）结构转录产物衍生而来的一种长为 19 nt25 nt 的单链 RNA。在每种高等动物中，存在 200 种以上的 miRNA，是最大的基因家族之一，约占基因组的 1%。siRNA：(short/small interfering RNAs)：即小干扰 RNA，是一种短片断双链RNA 分子，能够以同源互补序列的 mRNA 为靶目标降解特定的 mRNA，这个过程就是 RNA 干扰途径（RNA interference pathway）miRNA，siRNA，dsRNA 和 shRNA 都是 RNA 干扰技术中用到的小分子RNA，其不同之处在 miRNA 是单链 RNA，其余均为双链 RNA；siRNA 和dsRNA 相似； shRNA 需通过载体导入细胞后，然后利用细胞内的酶切机制得到 siRNA 而最终发挥 RNA 干扰作用。miRNA 与 shRNA 图示：shRNA（短发夹 RNA）的设计：1.克隆到 shRNA 表达载体中的 shRNA 包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，由 pol启动子控制。随后在连上 5-6 个 T 作为 RNA 聚合酶的转录终止子。2.两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点。 3.Stratagene 发现 29 个寡核苷酸较之原先推荐的 23 个寡核苷酸可以更有效的抑制目的基因。4.在启动子下游的酶切位点下方紧连一个 C，使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转录的发生。 5.ShRNA 目的序列的第一个碱基必须是 G 以确保 RNA 聚合酶转录。如果选择的目的序列不以 G 开头，必须在紧连正义链的上游加一个 G。 6.ShRNA 插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。不同大小和核苷酸序列的茎环都被成功的运用过。其中包含一个独特的限制性酶切位点的茎环利于检测带有 shRNA 插入片段的克隆。在比