三种藻类海洋中药多糖的提取及理化性质研究

三种藻类海洋中药多糖的提取及理化性质研究摘 要本论文以三种藻类海洋中药海藻、昆布、海茜为原料，采用热水回流提取的方法得到海藻粗多糖 HZ1，然后采用乙醇分级沉淀的纯化方法对 HZ1 进行初步的纯化，得到粗褐藻胶 HZ2 组分和粗褐藻糖胶 HZ3 组分。采用硫酸苯酚的方法对 HZ1 进行了总糖含量的测定。采用 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮高效液相色谱(PMP-HPLC)柱前衍生化方法对 HZ1 进行单糖组成分析，还用此方法测定了 HZ2 组分中甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的比例以及 HZ3 组分中岩藻糖的含量。此外，用高效凝胶渗透色谱法测定 HZ3 分子量。结果表明，海藻类中药多糖的理化性质既有相似又有不同，推测可能与海藻的种类、提取方法、采收季节、生长年限等有关。本研究为藻类海洋中药材的质量控制和药效物质基础研究提供了初步的实验数据。关键词：海藻多糖，理化性质，PMP-HPLC 柱前衍生Study on Extraction and Physicochemical Properties of three kinds of traditional marine Chinese medicinesAbstractIn this paper, three kinds of traditional marine Chinese medicines（haizao, kelp, Haiqian）were used as raw materials. Algae were extracted with water by heat under reflux method, thus, HZ1 crude polysaccharides were acquired, then two fractions crude alginate (HZ2) and crude fucoidan (HZ3) were obtained by fractional precipitation of HZ1 with ethanol. The content of total sugar in HZ1 was determined with phenol sulfate method. The monosaccharide composition using precolumn derivatization with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone (PMP); the ratio of mannuronic acid and guluronic acid in HZ2 and the content of fucose in HZ3 were also determined with this method. The molecular weight of HZ3 was measured by Gel Permeation Chromatography (GPC).Polysaccharides from different sources which are either similar or different on physicochemical properties. The composition of algal polysaccharides varies according to several factors such as species, extraction procedure, season of harvest and growth years. The results provided data to the quality control and material base of traditional marine Chinese medicines origin from algae.Key word : Seaweed polysaccharides; Physicochemical properties; PMP-HPLC precolumn derivatization目 录1.前言 .12.实验部分 .22.1 海藻粗多糖的提取纯化 .22.1.1 海藻多糖的提取 .22.1.3 分子量的测定 .42.1.4 结果与讨论 .52.2 单糖组成分析 .102.2.1 材料与仪器 .102.2.2 原理与方法 .102.2.3 结果与讨论 .122.3 褐藻糖胶含量测定 .132.3.1 材料与仪器 .132.3.2 原理与方法 .132.3.3 结果与讨论 .142.4 褐藻胶 MG 比测定 .152.4.1 材料与仪器 .152.4.2 原理与方法 .152.4.3 结果与讨论 .162.5 小结 .173. 综述 .184. 参考文献 .285. 致谢 .31三种藻类海洋中药多糖的提取及理化性质研究11.前言海洋中药系指以传统中医药理论为指导的海洋天然药物，我国是将海洋生物用作药物最早的国家之一。现存最早的医学著作黄帝内经中就有“乌贼骨作丸，饮以鲍鱼汁治血枯”的记载。经过几千年的积淀，海洋中药已经成为传统中医药的重要组成部分。 中华海洋药物辞典收载海洋药物1600种，包括动物药1431种，藻类中药125种，矿物药6种，其中海藻、昆布、海茜都是常见的藻类中药，具有消痰软坚散结，利水消肿之功效，常用于治疗瘿瘤、瘰疬和痰饮水肿等。海藻中的多糖是主要的活性成分之一，报道具有增强机体免疫力、抑制肿瘤细胞生长、抗菌和抗病毒等生理活性 1。研究中药海藻多糖对探讨海藻的药用物质基础具有极其重要的意义。中药海藻多糖主要由填充在细胞壁间的褐藻胶、褐藻糖胶以及褐藻淀粉三部分组成，是一类多组分混合物，三者的比例常因褐藻种类的不同而不同。褐藻胶亦称褐藻酸盐，为褐藻的胞间多糖，是由 -(14)-D-甘露糖醛酸（简称 M）和 -(14)- L-古罗糖醛酸（简称 G）组成的线形多糖。其分子中主要存在聚甘露糖醛酸(Polymannuronate, PM)、聚古罗糖醛酸(Polyguluronate, PG)和 G 与 M 交替共聚的 PMG 三种结构片段 2。褐藻胶在海蒿子中的含量为14.3%3，铜藻中褐藻酸 21.3%4，在海带中含量约为 19.7%，较为丰富 5；褐藻糖胶亦称岩藻多糖，岩藻聚糖，是一种细胞间多糖，主要由岩藻糖构成，另外分子中可能还含有糖醛酸、乙酰基、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖等；铜藻中褐藻糖胶的量为 6.1%，褐藻淀粉亦称海带多糖、昆布多糖、海带淀粉、昆布淀粉，主要由 -(13)-D- 葡萄糖组成，其上有 -(16)-D-葡萄糖分支。我国褐藻中褐藻淀粉含量不多，海蒿子中褐藻淀粉的含量为 0.57%，海带中的含量一般为 1%左右，马尾藻中以南方产的铜藻的含量较高，提取得率约为 4%6。目前对海藻多糖提取物的研究已取得一些进展，如对海藻多糖结构的研究主要集中于其所包含的糖单元及含量。本文对几种中药海藻多糖进行了提取并对部分理化性质进行了研究，以期为中药海藻多糖的药用物质基础的研究提供理论的参考。三种藻类海洋中药多糖的提取及理化性质研究22.实验部分2.1 海藻粗多糖的提取纯化2.1.1 海藻多糖的提取2.1.1.1 实验材料及仪器实验原料：本实验作用海藻药材购于全国不同产地，加工方式为直接晾干。本文对海藻多糖粗提物中总糖含量、单糖组成以及 M/G 和岩藻聚糖含量进行了测定，使用的海藻药材见表 1.1。表 1.1 实验用海藻药材中药 序号 原植物 拉丁名 批号 产地1 海蒿子 Sargassum paLLidum (Turn.) C.Ag. 001006742 福建2 海蒿子 Sargassum paLLidum (Turn.) C.Ag. 100301 山东3 海蒿子 Sargassum paLLidum (Turn.) C.Ag. 120701 山东4 海蒿子 Sargassum paLLidum (Turn.) C.Ag. 20120317 福建5 海蒿子 Sargassum paLLidum (Turn.) C.Ag. 101009351 福建6 羊栖菜 Sargassum fusiforme (Harv.) Setch 20120130 温州7 羊栖菜 Sargassum fusiforme (Harv.) Setch 201108 胶南8 羊栖菜 Sargassum fusiforme (Harv.) Setch 2012030281 温州海藻9 羊栖菜 Sargassum fusiforme (Harv.) Setch 2012050001 温州10 海带 Laminaria japonica Aresch. 20120210 青岛昆布11 裙带菜 Undaria pinnatifida (Harv.)Sur. 20120211 青岛12 铜藻 Sargassum horneri (Turn.)C. Ag. 2012080263 荣成海茜13 铜藻 Sargassum horneri (Turn.)C. Ag. 2012050002 温州岩藻糖标准品，购于美国 sigma 公司，乙醇、苯酚、浓硫酸、丙酮等均为分析纯试剂，购于国药集团化学试剂有限公司(上海)。电子分析天平 (梅特勒- 托利多仪器(上海) 有限公司)TU-1900 紫外分光光度计 (北京普析通用仪器有限责任公司)电热恒温水浴锅 (鹤壁华博电子科技有限公司)三种藻类海洋中药多糖的提取及理化性质研究32.1.1.2 实验方法13 种海藻，真空干燥箱 40干燥至恒重，粉碎过 40 目筛，准确称取 10g药材粉末，加入 10 倍量的水，100下冷凝回流 1h，3000rpm 离心 10min，收集上清液，重复提取两次(首次提取前浸泡半小时)。合并提取液，定容到100mL，精密量取 20mL，蒸干，称重，计算粗提物产率(命名为 HZ1)，其余加入 95%乙醇，调节乙醇的终浓度为 30%，醇沉 24h，沉淀用丙酮洗涤 3 次，得褐藻胶粗品( 命名为 HZ2)，称重，计算得率，上清继续用 95%乙醇，调节乙醇的终浓度为 80%，醇沉 24h，同样，沉淀用丙酮洗涤 3 次，得褐藻糖胶粗品(命名为 HZ3)称重，计算得率。提取工艺流程图，如下:海藻粉末 10g（40 目）加 10 倍量水，100 下回流二次每次一小时3000rpm 离心 10min提取液定容到 100mL蒸干计算得率HZ1精密量取 20mL加乙醇使醇含量达30%，静置 24h，离心沉淀HZ2加乙醇使醇含量达80%，静置 24h，离心HZ3沉淀弃去上清图 1: 海藻多糖提取流程2.1.2 粗提物总糖含量测定2.1.2.1 实验原理糖类物质与浓硫酸作用脱水，生成糠醛或糠醛衍生物。反应式如下：三种藻类海洋中药多糖的提取及理化性质研究4CHCHCCOHHOHO OHCHOHOH2CHH-H2O-H2O-H2O12345 -3H2OOHOH2C CHO图 2: 己糖脱水形成羟甲基糠醛结构糠醛或糠醛衍生物与苯酚溶液反应，生成黄至橙色化合物，在一定范围内，吸收值与糖含量呈线性关系，因此可比色测定。苯酚-硫酸试剂可与游离的寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸(或甲苯衍生物)起显色反应，己糖在 490nm 处(戊糖或糖醛酸在 480nm)有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。2.1.2.2 实验步骤(1)岩藻糖标准曲线的绘制：精密称取 105干燥至恒重的岩藻糖对照品 25mg 于 100mL 的容量瓶中，配成浓度为 250g/mL 的标准储备液，依次稀释成 125、62、31、16、8g/mL的溶液，各取 1.0mL 加入浓硫酸 2.5mL，混匀，加入 0.5mL 6%苯酚溶液，100水浴 15min，冷却，于 490nm 处测吸光度(每个浓度平行 3 次)。以横坐标为岩藻糖质量，纵坐标为吸光度值，得标准曲线。(2)样品总糖含量测定：精确称量各样品 25mg 于 100mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，配成浓度为 250g/mL 的供试溶液。分别取 1mL 于试管中加入浓硫酸 2.5mL，混匀，加入 0.5mL 6%苯酚溶液，100 水浴 15min，冷却，于 490nm 处测吸光度(每个样品平行测三次)。2.1.3 分子量的测定实验原理：采用凝胶渗透色谱法测定样品的分子量。该方法利用高分子溶液经过多孔性凝胶柱时，在凝胶柱上按其流体力学体积大小而进行分离。分子质量大的首先被淋洗出来，分子质量小的后被淋洗出来，从而达到按其分子尺寸大小分离的目的。实验用色谱条件：三种藻类海洋中药多糖的提取及理化性质研究5色谱柱：TSK-GEL GMPWXL(7.8*300mm)流动相：0.1M Na 2SO4 溶液 流速：0.5mL/min柱温：35 进样量：20L样品浓度：5mg/mL，过 0.22m 的水膜检测器：示差折光检测器(RID)标准品：右旋糖苷，分子量依次为6000、10000、21700、48800、113000、210000、366000、805000Da将右旋糖酐标准品用流动相配成 5mg/mL 的溶液后，依次进样，记录色谱图，利用 AgiLent GPC 软件处理，以右旋糖酐标准品的分子量对数 (LgMw)对保留时间 tR 作图，建立标准曲线。将 HZ3 粗提物用流动相配成 5mg/mL 的溶液后，按照上述条件，HPLC 分析，并代入标准曲线计算分子量。2.1.4 结果与讨论2.1.4.1 海藻粗多糖的提取本实验粗多糖的提取采用在 100水浴冷凝回流 1h，重复提取两次。利用乙醇沉淀法进行纯化。从结果来看，海蒿子粗多糖的得率从 11.00%-48.98%，不同批次的海蒿子得率差异较大，羊栖菜粗多糖得率从 22.97%-32.98%，得率相差较小，两批铜藻得率也相差较大，3 种中药海藻粗多糖的得率大多在 40%以下（3 号海蒿子除外） ；经过纯化后 HZ2 占生药材的 5%左右（10 号样品除外，可能是由于干燥不佳的原因） ；HZ3 占生药材的 4%左右，羊栖菜的含量比海蒿子高，海带的含量最低为 1.32%，两批铜藻之间相差也较大，原因可能是由于海藻的种类、产地、采收季节、生长年限等的影响，使得不同来源的海藻及相同来源不同批次的海藻多糖得率相差较大。三种藻类海洋中药多糖的提取及理化性质研究6表 2-1：不同组分粗提物得率HZ1 HZ2 HZ3中药 序号 来源占药材% 占药材% 占粗提物% 占药材% 占粗提物%1 海蒿子 11.00 3.53 32.07 2.64 23.982 海蒿子 28.99 4.85 16.72 2.40 8.273 海蒿子 48.98 5.34 10.90 4.75 9.694 海蒿子 12.86 0.28 2.17 2.32 18.055 海蒿子 18.73 2.10 11.07 4.44 23.416 羊栖菜 25.00 1.67 6.70 4.15 16.627 羊栖菜 32.98 4.91 14.88 4.90 14.858 羊栖菜 31.00 6.84 29.78 5.08 16.39海藻9 羊栖菜 22.97 7.35 32.00 2.93 12.7710 海带 27.99 27.69 98.94 1.32 4.71昆布11 裙带菜 39.99 7.81 36.28 2.57 6.4312 铜藻 26.98 0.43 1.59 2.37 8.77海茜13 铜藻 18.00 0.61 3.39 5.19 28.862.1.4.2 总糖含量测定本实验采用硫酸苯酚法。在硫酸的作用下，单糖与苯酚缩合生成有色化合物，在 490 nm(己糖) 或 480 nm(戊糖) 处有最大吸收，且吸光度和糖含量呈线性关系，吸光度可用紫外可见分光光度计检测。此法灵敏度高，稳定性强，重现性好。本实验下一步欲对褐藻糖胶含量进行测定，且结合文献报道，海藻多糖粗提物中均含有褐藻糖胶，故选取岩藻糖作为标准品，进行总糖含量的测定。三种藻类海洋中药多糖的提取及理化性质研究7图 3：总糖含量测定标准曲线以岩藻糖浓度 C(g/mL)为横坐标，以吸光值 A 为坐标，绘制标准曲线(图 3)，得回归方程 y = 0.0093 x - 0.0099 ，R = 0.9991。在岩藻糖浓度为 4-62g/mL 范围