miRNA的作用机制及功能探讨进展

中国科学 C 辑:生命科学 2009 年 第 39卷 第 1期: 109 113 109 中国科学杂志社 SCIENCE IN CHINA PRESS MicroRNA 作用机制研究的新 进展 赵爽 刘默芳 中国科学院上海生命科学研究院 生物化学与细胞生物学研究所 分子生物学国家重点实验室 上海 200031 联系人 E-mail: 收稿日期: 2008-09-04 接受日期: 2008-11-28 国家重点基础研究发展计划批准号: 2005CB724603 和国家自然科学基金批准号: 30770474 资助项目 摘要 microRNAmiRNA 是一种非蛋白质的新型基因表达调控因子 对真核生物基因表达起非常重要的调控作用. 关于 miRNA的 功能 及作用机制方面的研究是当前生命科学研究的前沿热点 研究人员陆续提出了一些假说模型 诸如翻译起始抑制、翻译起始后抑制、mRNA降解、P 小体 Processing Body SGStress Granules颗粒扣押靶 mRNA等来阐述 miRNA 如何抑制其靶基因的表达. 此外 最近还有文献报道了一些全新的 miRNA作用方式 如去抑制和 miRNA 激活作用等. 本文将简要介绍一些 miRNA作用机制研究的新进展及相关作用模型. 关键词 miRNA 负调控 去抑制 正调控 P 小体 SG 颗粒 准确的基因表达调控对生物体的生长发育和功能至关重要 基因表达调控异常是疾病发生的主要原因. 在过去的数十年间 对基因表达调控的研究主要集中在蛋白质转录因子介导的基因表达调控方面. 研究发现 它们通过激活或抑制基因转录控制基因的表达 在基因组信息转化为分子效应和生物效 应过程中发挥着重要的作用. 最近 在动、植物及病毒等生物中发现了一系列小分子非编码 RNA small noncoding RNA 包括miRNAmicroRNA siRNA small interfering RNA piRNApiwi-interacting RNA和 esiRNA endogenous siRNA等 它们分别在转录水平、转录后水平及表观遗传水平等方面控制基因的表达 组成了 RNA 调控网络 调控包括细胞增殖、分化和凋亡等一系列生理进程 影响生物体的生长发育 并与多种人类疾病的发生密切相关 1. 这些小分子 RNA的发现 揭示了真核生物一种新的基因表达调控方式. miRNA 是小分子非编码 RNA家族的重要成员. miRNA 与 siRNA共用生成途径和作用途径中多种蛋白质因子. 但二者也有一些明显的区别 如 siRNA主 要是由外源提供的小分子 RNA 通过引发靶 mRNA的切割负调控靶基因的表达 而 miRNA是基因组编码的内源性小分子 RNA 通常在翻译水平负调控靶 mRNA的表达. miRNA 基因由 RNA聚合酶或/和 转录 23. 动物 miRNA加工成熟一般需要两个 RNase 家族酶Drosha和 Dicer参与. 最近发现 AgoAr- gonaute蛋白在miRNA加工成熟中也发挥作用 4. miRNA调控是通过 RNA诱导基因沉默复合物 RNA- induced silencing complex RISC完成的 复合物的核心成员是 Ago 家族蛋白 还有一些功能未知、非 RISC核酸酶活性必需的蛋白成分 如 FXRP RNA 解旋酶等 也存在于复合物中 56. 通常认为 miRNA 与 Ago1结合 组成 miRNA效应器复合物 miRNA- RISC miRISC 执行靶mRNA翻译抑制 而 siRNA与 Ago2结合 组成 siRISC 执行靶mRNA降解 7. 最近有人对这种 miRNA/siRNA分选模型进行了校正 认为 miRNA/siRNA都可以被 Ago1或 Ago2结合 89 这为 miRNA介导切割提供了可行性. 过去认为 Dicer生产的 miRNA: miRNA双链 miRNA 作为向导链被组装入 miRISC 互补链 miRNA则被迅速降解. 但最 赵爽等: MicroRNA 作用机制研究的新进展 110 近研究发现 虽然 miRNA种类不如对应的 miRNA丰富 但它们常常以适当的生理水平存在 并同样可以被 Ago蛋白结合 10. miRNA主要是通过 5端被称为种子序列 Seed Sequence的 7 nt序列与位于靶 mRNA 3UTR 的 miRNA调控元件 miRNA Regulatory Element MRE相互作用 识别靶 mRNA11. 一些靶 mRNA 的其他特征 如 MRE附近富含 AU序列、靶 mRNA与 miRNA的 1316位碱基配对、MRE距离终止密码子 15 nt以外、不位于长 3UTR 的中间、邻近共表达 miRNA的识别位点等 可增加 miRNA的作用效率12. miRNA与靶 mRNA之间的配对程度决定了 miRISC抑制靶mRNA的方式: 高度配对的 miRNA 如大部分植物 miRNA 将通过类似于 siRNA的作用机制 导致靶 mRNA切割和降解 相反 在动物中大部分 miRNA与靶 mRNA不完全配对 则可能是通过翻译抑制发挥作用. 在过去的几年间 研究者陆续提出了一些不同的、甚至互相矛盾的假说模型 来解释 miRNA如何抑制其靶基因表达. 但对 miRNA准确的作用机制 目前还没有统一的观点. 本文将简述 miRNA 作用机制研究的新进展及 miRNA的一些新功能. 1 miRNA 翻译起始抑制机制 关于miRNA翻译起始抑制机制目前主要有 3种观点: 第一种观点认为 miRNA可能通过抑制全能性核糖体的组装而阻断翻译起始 13. 因为研究发现被 miRNA沉默的 mRNA没有或鲜有偶联完整的核糖体 部分研究者认为 miRNA可能通过抑制全能性核糖体的组装而阻断翻译起始 13. 这种观点被至少两个新近的证据支持: Thermann 等人 14在一个体外研究中发现 果蝇的 miR-2抑制全能性核糖体的前体-48S 翻译复合物的组装 该复合物添加 60S亚基后即形成全能性核糖体 Chendrimada等人 15发现 EIF6 是一种可以抑制核糖体 40S和 60S亚基结合、阻断 80S全 能性核糖体形成的蛋白 与Ago/RISC直接相互作用 并且在哺乳动物和线虫中 缺失EIF6影响 miRNA介导基因沉默. 然而 RISC 是否通过与EIF6相互作用诱导 40S和 60S核糖体解聚还有待于进一步的研究. 第二种观点根据 miRNA 抑制要求靶 mRNA m7G 帽子的存在 认为 miRISC 可能抑制翻译起始复合物的形成1316. 这个假说最近也找到了一些新证据: 研究者在一个体外系统中发现 增加 eIF4F复合物含有 m7G 帽子结合蛋白、翻译起始因子 eIF4E水平可回复 miRNA翻译抑制 17 与之一致的是 另一个研究组 18发现 Ago2 中间结构域类似于eIF4E 具有结合 m7G 帽子的活性 推测经 miRNA招募到靶mRNA 3UTR 的 Ago2 与起始复合物 eIF4E/G竞争结合 m7G帽子 从而抑制翻译起始复合物的形成. 此外 miRNA 还可能通过阻止 polyA结合蛋白 poly A binding protein PABP 与 mRNA结合影响翻译起始. Wakiyama 等人 19发现 miRNA引起靶 mRNA脱腺嘌呤反应 deadenylation 导致 mRNA 的polyA尾巴缩短 但 mRNA的稳定性似乎并不受影响 只是polyA 尾巴缩短使 PABP结合 mRNA受阻 从而影响了翻译起始. 2 miRNA 翻译起始后抑制 虽然上述证据支持 miRNA抑制翻译起始 但也有研究发现 一些被 miRNA抑制的 mRNA与翻译活跃性的多核糖体偶联 说明有一些 miRNA的抑制作用不是发生在翻译起始 2021. 此外 Petersen 等人 22发现 经内部核糖体进入位点 Internal Ribosome En-try Site IRES起始、不依赖于 mRNA m7G帽子的翻译也可以被 miRNA抑制 这进一步证明 miRNA抑制是发生在翻译起始之后. 虽然这些研究证明了 miRNA沉默作用确实是发生在翻译起始后、新生多肽完成前 但关于 miRNA究竟如何在翻译起始后发挥抑制作用 目前还没有一致的结论. 研究者推测 miRNA可能引起新生多肽链的翻译同步降解 21 或者是在翻译延伸过程中 miRNA 引发大量的核糖体脱落及高频次的翻译提前终止 产生的不完整多肽产物则被迅速降解 22. 3 miRNA介导 mRNA衰减 Wu 等人 23首先发现 miRNA 可以诱导与之不完全配对靶 mRNA的衰减 下调靶 mRNA的水平. 这种 miRNA诱导 mRNA衰减的作用机制被随后的证据所支持 24 如在斑马鱼的早期胚胎发育中 miR-430 控制母本 mRNA的代谢 表明 miRNA介导的 mRNA衰减机制具有生理学意义 25. 与之一致的是 Ago 蛋白被发现定位于细胞中降解 mRNA的 RNA颗粒RNA 中国科学 C 辑: 生命科学 2009 年 第 39卷 第 1期 111 granules 如 P小体 processing bodies中 这些 RNA颗粒中包含常规的 mRNA降解酶 如脱腺嘌呤酶、脱帽酶、核酸外切酶等 提示这些 mRNA降解酶可能参与 miRNA介导的 mRNA衰减 2627. 此外 miRISC 的核心成分Ago 家族蛋白有多种异构体 其中一些成员的内切酶活性也可能协助miRNA介导的 mRNA的切割和/或衰减 2428. 总之 这些证据都表明 miRNA 可以直接或间接介导靶 mRNA的降解 这改变了最初认为的 miRNA调控仅翻译抑制作用的观点. 4 RNA 颗粒扣押、降解或储存靶 mRNA 胞浆的 RNA 颗粒 如 P小体和SGStress Gran-ules颗粒 在转录后水平的基因表达调控中具有重要的作用 它们是细胞储存处于翻译抑制状态 mRNA 的场所. 在此 mRNA 被降解或/和释放重新进入翻译机器 29. P小体含有多种 mRNA衰减机器的组分 被认为是细胞的mRNA代谢场所 SG 颗粒特异性地在受胁迫条件下形成 因此被命名为胁迫颗粒 Stress Granule. 从组成成分看来 SG颗粒更倾向于沉默 mRNA翻译 而不降解 mRNA. P小体和 SG颗粒常常彼此并列 动态关联 二者含有一些相同的组分 如帽子结合蛋白 eIF4E 和翻译抑制子 rck/p54 但它们的成分并不完全相同 暗示可能有功能差别. 因为发现它们与miRNA作用相关联 可能是 miRNA的胞内作用场所 这两种RNA颗粒最近受到特别关注. 一些证据表明 在 miRNA存在下 miRISC 中的核心组分及与 miRISC结合的 mRNA定位于 P小体和 SG颗粒中 262730. 而且 有证据表明 P 小体的形成与 RNA 沉默相关联 抑制 P小体的形成将抑制 miRNA介导的翻译抑制 反过来 抑制 RISC也同样抑制 P小体的形成 更值得注意的是 一些研究证明 siRNA/miRNA 都可以在哺乳动物细胞和果蝇细胞中诱导 P小体的形成 31. 鉴于 P小体和SG颗粒的内在联系 可以推测 P小体和 SG颗粒可能执行相互联系但又不同的功能. 推测被 miRISC结合的 mRNA进入P小体和 SG颗粒中 即被这些 RNA颗粒中的翻译抑制子剥夺了与核糖体和翻译机器结合的可能性 从而使 mRNA处于翻译抑制状态 达到了基因沉默的目的. 但是 扣押的 mRNA下一步命运如何尽管不少的证据支持 miRNA介导靶 mRNA的衰减 但也发现 在很多情况下 miRNA 仅降低了靶基因的蛋白水平 靶基因的 mRNA水平却无明显变化. 这使得我们有理由推测 在靶 mRNA被扣押到 RNA颗粒解除翻译后 可能随即会进行一个 mRNA 衰减或储存的分拣步骤. P 小体和 SG颗粒极有可能分工执行 mRNA降解和储存功能. 在某些胁迫条件下 miRISC 结合的 mRNA是否有可能首先被送到 SG 颗粒 被抑制翻译和临时储存 然后在细胞估算 mRNA确实已过量后再转运到富含 mRNA代谢酶的 P小体中进行降解事实上 在 miRNA存在下 Ago 蛋白与 SG颗粒呈动态联系 SG 颗粒中的酶发挥翻译沉默而不是 mRNA衰减的作 用 30. 还有研究发现 一些诱导 SG颗粒形成的胁迫作用确实减少了 P小体的形成和 mRNA衰减 32. 但目前还不清楚 miRISC偶联 mRNA在胁迫条件下聚积到 SG颗粒中的生理作用是什么. 5 miRNA正调控和去抑制 最近的研究发现了一些新型的miRNA作用方 式 如 miRNA正调控和去抑制等. 首先 Vasudevan实验室 336535 发现 miRNA 不总是基因表达的负调控因子 在一些条件下 miRNA 也上调基因表达. 他们发现 在细胞周期过程中 miRNA 效应在抑制作用和活化作用间摆动. 在静态细胞中 G0期 miRNA 活化翻译和上调基因表达 而在其他细胞循环/增殖期则继续发挥抑制作用 35. miRNA激活作用与富含腺嘌呤/尿嘧啶元件 AU rich element ARE相关 33. ARE是 miRNA活化翻译的信号 在miRNA指导下 miRISC 复合物成员如 Ago FXRP被招募到 ARE上 激活翻译、上调基因表达 34. ARE元件是一种 mRNA不稳定元件 位于 mRNA 3UTR 严重影响其宿主 mRNA的稳定性. 研究已发现 ARE元件介导的 mRNA 衰减调控与 miRNA介导的 mRNA衰减调控有多种联系 36. 另外 最近研究发现 在一些条件下 miR-10a 也正调控基因表达. miR-10a 结合到核糖体蛋白 mRNA 5UTR 促进其翻译 提高核糖体蛋白合成 从而刺激核糖体生成 进而正调控总蛋白质的合成 37. 研究发现 miRNA 的抑制作用是可逆的 一些 RNA 结合蛋白可能在这一过程中发挥重要作用 38. 在人体细胞中观察到 胁迫条件下 被 miRNA 抑制 赵爽等: MicroRNA 作用机制研究的新进展 112 的 mRNA可以去抑制 重新进入翻译机器 HuR 一个 ARE元件结合蛋白 可能通过促进 miRISC-靶 mRNA复合体解离和 P小体解聚 去除 miRNA的抑制作用 39. 另一个RNA结合蛋白 Dnd1 在生殖系细胞中与 miRNA紧密联系 它可能通过结合在 mRNA的 U丰富区 U-rich mRNA region 屏蔽 miRNA的结合位点 阻止 miRNA接近靶 mRNA 解除 miR-430家族的抑制效应 40. 最近 Sandberg 等人 41还报道了一种逃避 miRNA抑制的新方式. 他们发现 一些在增殖细胞中表达的 mRNA 3UTR 保守性地缩短 导致 miRNA的靶位点减少 从而避免了 miRNA的负调控作用. 本实验室对 miR-155与它的一个靶基因在部分乳腺癌中同时高表达的原因进行了调查 发现在一个乳腺癌样本中 该 mRNA与 miR-155种子序列配对的第 8位 A