乙肝抗病毒药物综合分析

1乙肝抗病毒药物综合分析我国是乙肝大户，有 1.2 亿乙肝病毒携带者，其中，乙肝患者有 3000 万人以上，目前，乙肝病毒已成为严重威胁我国人们身体健康的主要传染病之一；乙肝疫苗可预防在未感染人群中的传播，但对已感染乙肝病毒的人群，还需用药物进行治疗，控制和杀灭乙肝病毒的手段有生物制剂、核苷类化学药、中药等药物治疗，在众多治疗药物中，还未能真正清除体内乙肝病毒的药物，甚至，有些药物在停药或病毒产生耐药性后，病毒出现爆发性扩增，造成肝脏严重损伤。要发现并开发出更有效的抗乙肝病毒药物，只有充分了解乙肝病毒具有独特的病毒特征和感染复制周期的特点， ，才能找到更有效预防和治疗乙肝病毒的方法或手段。本文从以下几方面进行阐述和分析，以图找到更合理、科学的药物开发方向和治疗手段；内容包括：1、乙肝病毒结构及复制周期的特殊性分析；2、控制和杀灭病毒关键环节的分析；3、现已上市和正在研发的抗乙肝病毒药物优点及存在不足的分析；4、形成更有效抗乙肝药物的可能途径。一、乙肝病毒结构及复制周期的特殊性分析乙肝病毒从其感染周期及结构上，都具有与其他病毒不同的特征；首先从结构上，感染型乙肝病毒颗粒具有以下特征：1、 有两层外鞘蛋白结构保护核心乙肝 DNA，其中外层是由脂质双层膜镶嵌乙肝病毒表面抗原（HBsAg）构成，内层由乙肝病毒核心抗原(HBcAg)包裹，乙肝病毒 DNA依附在核心抗原上。2、 乙肝病毒 DNA 双链中正链是不完整、有缺失，需要在进入细胞核，在 DNA 聚合酶作用下延长形成完整的正链。3、 在细胞核中形成的完整、闭合的双链 DNA(ccDNA)具有对细胞中 DNA 酶、药物等2形成抗性的特征。乙肝病毒感染复制具有以下特征：1、 乙肝病毒具有嗜肝细胞特征，而引导病毒进入肝细胞的决定因素在于乙肝病毒外层膜结构，HBsAg 是导向病毒颗粒进入细胞的关键因素，而脂质双层膜结构容易与肝细胞膜融合，使乙肝病毒顺利进入肝细胞内。2、 包裹 DNA 内层的 HBcAg 的作用既有保护病毒 DNA 被细胞质中 DNA 酶的破坏，同时可导向病毒 DNA 进入高尔基氏体和细胞核中。3、 在细胞核中 DNA 聚合酶的作用下，以负链为模版，延长正链，两条 DNA 链以共价、闭环的形式存在（cccDNA） 。4、 cccDNA 在转录酶的作用下，形成 mRNA 和 tRNA，mRNA 在细胞浆中翻译 HBcAg和 HBsAg，tRNA 作为模版，在逆转录酶的作用下，形成乙肝病毒 DNA 负链，以负链为模版，在 DNA 聚合酶作用下，复制不完整的正链，在整个的逆转录和复制的过程中，tRNA 和 DNA 负链都必须附着在 HBcAg 蛋白上进行。5、 形成的外包裹 HBcAg 的病毒双链 DNA 可进入两条通道，一条通道再次进入细胞核，形成 cccDNA，另一条通道进入高尔基氏体，形成由 HBsAg 镶嵌的脂质双层膜的完整乙肝病毒颗粒，细胞以“吐泡”的方式排出乙肝病毒。6、 完整的乙肝病毒颗粒具有传播感染能力，而在肝组织中感染途径主要以细胞间桥（细胞间通路）进行扩散为主，其次肝组织组织液间传播，以至整个肝组织细胞中都存在乙肝病毒。7、 乙肝病毒感染肝细胞，并不象许多病毒感染后引起细胞破裂或坏死，乙肝病毒并不直接损伤肝细胞，只是间接影响肝细胞蛋白质合成及肝细胞再生，直接对肝细胞发生破坏和损伤的是激发自身免疫系统，从而发起对带有异种抗3原的肝细胞攻击。二、控制和杀灭乙肝病毒关键环节的分析防止乙肝病毒对肝细胞的侵入并在肝细胞中的扩增，是控制和杀灭乙肝病毒的关键。从乙肝病毒的结构特征和复制、装配的特点，通过控制和抑制以下环节，都能有效达到阻止乙肝病毒对肝细胞的侵入及病毒扩增：1、 乙肝病毒颗粒的外层膜（脂质双层膜镶嵌 HBsAg）是引入病毒进入细胞的关键，如破坏此层膜结构，将阻断乙肝病毒进入肝细胞及阻断乙肝病毒在肝细胞间的传播。理论上，使用表面活性剂，可破坏膜结构，以阻断病毒侵入肝细胞；通过 HBsAg 免疫疫苗激活免疫系统产生抗体或注射 HBsAg 抗体，通过“空间位阻”效应，可阻断乙肝病毒进入细胞，也可通过激活免疫系统，将病毒体清除。2、 控制或抑制 cccDNA 转录 mRNA、tRNA，或加速病毒 mRNA、tRNA 破坏。如阻断了mRNA 的形成，就可阻断 HBcAg 及 HBsAg 以及逆转录酶蛋白产生，如阻断了 tRNA的形成，就阻断了 RNA 逆转录 DNA。要达到此目的有三条途径：a、抑制 cccDNA转录 RNA 的启动子，但 cccDNA 是以共价、闭环的结构存在，外界因素很难对其结构发生攻击；b、抑制或阻断转录酶的作用，DNA 转录 RNA 是通过 RNA 转录酶的作用完成的,但 RNA 转录酶是肝细胞自身存在的酶，如抑制了 RNA 转录酶，则肝脏中其他功能蛋白的形成将被抑制，毒性比较大。c、加速病毒 mRNA、tRNA的破坏，干扰素的抗病毒作用的机制可以给予启示，IFN 的抗病毒活性主要通过三条途径完成：双链 RNA 依赖的蛋白激酶途径(PKR，可抑制病毒蛋白的翻译)、2-5A 系统(可分解病毒 RNA)和 MX 蛋白(干扰病毒的复制和转录)。干扰素主要的作用，就是激活细胞自身清除异物的功能，达到清除病毒。3、 抑制乙肝病毒 DNA 聚合酶以及 RNA 逆转录酶的功能，乙肝病毒在肝细胞中的聚4合酶以及自身形成的逆转录酶的作用下，逆转录形成负链 DNA，并以负链为模版，在聚合酶的作用下，复制正链。通过抑制逆转录酶和聚合酶的作用，就可阻断乙肝病毒 DNA 链的复制及病毒 DNA 的扩增；目前，大部分已上市的核苷类抗乙肝病毒药物都属于此类作用机制，作用的形式主要通过嘧啶或嘌啉的拟似物或通过代谢后形成的拟似物，通过拟似物以底物竞争性抑制或将拟似物在复制过程中整合在延长的 DNA 链上，阻断了逆转录酶和聚合酶对 DNA 链的延长以及 DNA 链的复制。4、 阻断或破坏 HBcAg 在乙肝病毒扩增过程中发挥的功能；HBcAg 不仅仅是乙肝病毒的结构蛋白质成分，HBcAg 在乙肝病毒整个复制和扩增过程发挥重要作用，主要体现在：a、保护乙肝病毒转录和复制过程中形成的 RNA 和 DNA，免遭细胞中的 RNA、DNA 酶的破坏，因在细胞浆裸露存在的 DNA、RNA 易被酶破坏；b、在乙肝病毒逆转录和复制过程中，HBcAg 充当逆转录酶和聚合酶的附着点，只有HBcAg 结构完整，才能保证酶高效、有序完成逆转录和复制的过程，当 HBcAg结构被破坏，乙肝病毒逆转录和复制过程将被终止；c、在细胞浆形成的不完成DNA 双链，只有通过 HBcAg 导入，才能进入细胞核，在细胞核聚合酶的作用下，形成共价、闭环、完整双链的乙肝病毒 DNA（cccDNA） ；没有 HBcAg 的导入，就不能完成在细胞内 cccDNA 的循环。三、药物及生物制品在抗乙肝病毒作用中的优缺点分析应用于乙肝病毒预防和治疗的药物，可以分成三大类：1、生物制品，包括乙肝疫苗、乙肝病毒（HBsAg）免疫球蛋白以及干扰素；2、核苷类抗乙肝病毒化药；3、中成药，主要作用在于保肝、护肝、退黄疸等作用，在此不做重点分析。（一） 、生物制品抗病毒作用优缺点分析5针对抗乙肝病毒的生物制剂，主要是乙肝疫苗、抗乙肝病毒免疫球蛋白和干扰素，其他如 IL-1、IL-2 以及胸腺肽应用乙肝病毒的治疗在临床上不常用。A、乙肝疫苗自 20 世纪 70 年代以来，随着生物技术的发展，FIB 疫苗也不断更新换代，从第 1 代血源性乙肝疫苗(PDV)，到第 2 代基因工程 FIB 疫苗，目前已进入第 3 代卸 3sAg 合成肽段FIB 疫苗的研制。由于 PDV 的血浆原料减少。难以大量生产，同时经 3 步灭活不足以将其中已知和未知的潜在致病因子全部杀灭，目前广泛使用的是基因工程乙肝疫苗.基因工程乙肝疫苗是把修饰、剪接的 HBsAg 基因编码片段转给酵母、哺乳动物细胞等，而获得高效表达的 HBsAg，作为生产 HB 疫苗的原料。主要有重组酵母 HB 疫苗(YDV)、中华地鼠卵巢细胞(CHO)表达的重组 FIB 疫苗和重组痘苗病毒疫苗 3 种， 目前应用最广泛的是重组酵母 HB 疫苗(YDV)。基因工程乙肝疫苗的免疫原性、安全性、免疫持久性、保护率和阻断母婴传播等方面在实践中都已得到了充分证实。基因工程乙肝疫苗在国内外的广泛使用中取得了明显成功，在现阶段是防制 HBV 传播的根本性措施也是控制 HB 的最有效策略。乙肝疫苗是主动免疫，通过注射无毒的乙肝疫苗（HBsAg 片段） ，出发自身产生抗HBsAg 的 IgG 抗体，产生的抗体可以与来自于血源或体液感染的乙肝病毒结合，激活补体系统和天然的免疫系统，对病毒杀灭，阻断了乙肝病毒从血液及体液进入肝细胞途径，对于预防感染乙肝病毒起重要作用。但乙肝疫苗仅限于未感染乙肝病毒的人群使用，一旦感染了乙肝病毒，注射乙肝疫苗对控制和杀灭病毒作用不大，反而会激活自身免疫系统对携带 HBsAg 的肝细胞发生攻击，造成肝组织损伤。原因在于乙肝病毒一旦进入肝细胞后，复制、装配形成的感染型病毒颗粒，释放形式主要不是通过破坏细胞后，病毒进入血液或组织液进行传播，而是通过细胞6间桥的方式直接传播其他未感染的肝细胞，此时，通过免疫疫苗产生的抗体不能阻止此种途径的传播。附：治疗性乙肝疫苗的分析目前，国内外有多家研究机构和跨国公司正在开发治疗性乙肝疫苗。从免疫学的角度分析，对大部分病毒，自身免疫发挥抗病毒作用，主要是通过细胞免疫和淋巴因子发挥作用的，而体液免疫抗病毒方面的作用，除呼吸道、生殖道和肠道通过分泌型 IgA（sIgA）抗体发挥抗病毒作用外，其他产生的抗体反而起到免疫抑制和免疫耐受的作用。基于以上的考虑，治疗性免疫疫苗的开发，重点在于激发细胞免疫和淋巴因子的形成，激活的自身细胞免疫直接对携带乙肝病毒的肝细胞发生攻击，从而杀灭乙肝病毒。治疗性乙肝疫苗使用的抗原有：乙肝病毒 DNA、灭活乙肝病毒、重组 HBsAg 抗原，但乙肝病毒 DNA，抗原的免疫原性弱，不易激活免疫系统；灭活的乙肝病毒作为抗原，存在还有残留病毒活性（因乙肝病毒抵抗理化因素杀毒的能力强）的风险。通过激活的特异性免疫反应，对肝细胞中的乙肝病毒发生攻击，参与免疫攻击的细胞主要由 Tc、k 细胞、NK 细胞以及细胞毒因子，使携带乙肝病毒的肝细胞都成为免疫攻击细胞的靶细胞，在攻击的过程中，不仅把乙肝病毒杀死，同时，把携带乙肝病毒的肝细胞也出现损伤或被杀死；在这种状况下，在临床应用过程中，有可能出现大面积肝组织坏死风险。治疗性乙肝疫苗，尽管目前已成为国内外机构和公司研究的热点，但其存在以下不足：、其使用的乙肝病毒抗原，免疫原性弱，不易激发免疫系统引起特异性免疫反应，产生抗病毒作用的效果差。、在携带乙肝病毒的人群中，有相当部分的人群血液中存在乙肝病毒的抗体，当使用外源性抗原时，容易与自身产生的抗体发生反应，形成免疫复合物，造成包括肾等组织的损伤；或增加外源性抗原，进一步强化了免疫耐受（免疫无应答） 。7、大部分乙肝病毒携带者，随着感染时间的延长，肝组织中许多肝细胞都存在乙肝病毒，当激活特异性免疫反应时，将引起大量的肝细胞坏死。正因为存在以上不确定因素及风险，大多数研究和开发治疗性乙肝疫苗的机构和公司，已从研究热点逐渐转变更理性，众多治疗性乙肝疫苗在 I 期临床就放弃进一步开发。B、干扰素干扰素可以大体分成 I 型干扰素和 II 型干扰素，I 型干扰素主要包括人体内发现的、 以及在反刍动物中发现的 ，以及小鼠中发现的 等几个亚族；所有的I 型干扰素基因来自于一个共同祖先基因，位于同一条染色体上的相邻位置(人 9 号染色体和小鼠 4 号染色体)。型干扰素只有一种 干扰素，也被称为免疫干扰素，IFN 主要由活化的 T 细胞产生。最近发现的 干扰素被认为是新的一族干扰素。IFN 的抗病毒活性主要通过三条途径完成：双链 RNA 依赖的蛋白激酶途径(PKR，可抑制病毒蛋白的翻译)、2-5A 系统(可分解病毒 RNA)和 MX 蛋白(干扰病毒的复制和转录)。具体抗病毒表现为：干扰素可与肝细胞表面特异性受体结合，促进 2-5寡核苷酸的合成，继而激活内源性核糖核酸，降解病毒，裂解受感染细胞内的信使核糖核酸(mRNA)，使病毒特异性蛋白合成减少，还可通过介导真核启动因子-2a 亚单位磷酸化，阻断HBV、HCV 的 mRNA 在人体肝细胞内的传递和病毒细胞蛋白的合成。通过特异性的抗原激活产生的干扰素，具有针对性抗带有特种抗原的病原的杀伤，干扰素本身没有直接的杀病原的作用，它主要通过激活自身细胞内的清除系统，抑制 DNA 转录 RNA，以及激活 DNA、RNA 水解酶，分解和破坏病原 DNA 和 RNA，从而达到清除病原体的作用，尤其在自身抗病毒方面，干扰素起到重要作用。但不同来源的干扰素具有种属特异性，只有针对病原体产生的特异性干扰素，才能发挥最好的作用，否则，外源性的干扰素在抗病毒的过程中，不仅对病原体 DNA 和 RNA 有干8扰和破坏作用，对正常细胞的 DNA 转录，RNA 翻译蛋白的过程也会受到影响（主要体现在干扰素不良反应方面） 。要充分发挥干扰素抗病毒作用，需要满足两个条件：、产生的干扰素没有种属差异性，要满足此条件，只有自身正常细胞产生的干扰素才具备；、产生的干扰素具有针对特定病原体的特异性。要达到以上条件，只有用特异性病原体或抗原刺激正常细胞或免疫细胞，产生的干扰素才能发挥最佳的抗特定病原体的作用。但，临床上常用的干扰素，绝大部分是从不同种属来源的干扰素，存在种属差异性，而且不是针对特定病原体产生的干扰素，其抗特定病原体的作用下降。（二） 、核苷类抗乙肝病毒作用优缺点分析目前，上市的抗乙肝病毒化学药物大部分为核苷类药物，通过代谢或直接作为酶底物形成嘧啶或嘌呤拟似物，整合在复制过程中的 DNA 链上，阻断 DNA 链的延伸，作用的靶点主要为抑制 RNA 逆转录酶和 DNA 复制酶，以控制和降低病毒 DNA 载量。目前，已上市的各核苷类抗乙肝病毒药的理化特性、作用特点、代谢特征以及安全性。核苷类抗乙肝病毒的作用可归纳为以下三条途径：、通过形成代谢产物，以底物的形式与正常的核苷与聚合酶发生竞争性抑制作用，使乙肝病毒 DNA 负链不能正常复制正链DNA，不能形成完整的乙肝病毒 DNA 双链，所有的核苷类药物都具有此作用；、抑制 RNA逆转录酶作用，使乙肝病毒负链 DNA 不能形成，恩替卡韦具备此作用；、在 DNA 聚合酶的作用下，将核苷拟似物整合在复制过程中的 DNA 链中，使复制过程终止。抑制 RNA 逆转录酶和 DNA 聚合酶的核苷类药物，聚合酶和逆转录酶对产物（DNA 链）具有催化放大的效应，当核苷类药物抑制以上两类酶的催化放大效应，将很快反映病毒 DNA载量的急剧下降，乙肝病毒的扩增和传染将得到控制。但核苷类药物存在以下不足：、抑制了聚合酶和逆转录酶的作用，但对 cccDNA 转录RNA 的过程没有作用，当复制过程受到抑制时，cccDNA 的转录将反馈性扩大转录，细胞将9出现更多的 mRNA 以及 tRNA，对病毒蛋白的翻译不受影响，反而有扩增，大量的HBsAg、HBcAg 抗原形成，大量 HBsAg、HBcAg 分泌，将导致免疫进一步耐受。、核苷类药物是酶（聚合酶、逆转录酶）的竞争性底物，起竞争性抑制作用，与底物浓度显正相关的关系，浓度越高，其抑制作用越强，当无法控制 DNA 的转录时，产生的逆转录酶以及逆转录模版会因此增强，将引起酶对抑制底物的“逃逸”现象，RNA 的逆转录和 DNA 的复制继续进行。、抑制性底物持续的作用，将诱导病毒 RNA 和 DNA 的变异，将回避抑制性底物对酶的抑制作用，这种变异导致的耐药性的强弱，与作用靶点多少与直接关系，作用于多个靶点的药物，变异产生的耐药性的几率要小，如恩替卡韦对多个靶点（即抑制聚合酶，也抑制逆转录酶）起抑制作用，其抗病毒的作用比其他核苷类药物强，同时产生耐药的几率也降低。四、形成更有效治疗和预防乙肝病毒的途径通过对控制乙肝病毒复制的关键环节，以及对用于抗乙肝病毒药物作用的优缺点分析，要正真达到更有效控制或杀灭乙肝病毒，需要从控制乙肝病毒转