多糖的提取分离工艺研究

多糖的提取分离工艺研究多糖是由单糖连接而成的多聚物，人们对多糖的研究已经有很长时间的历史，对多糖的初始研究可追溯到 1936 年 Shear 对多糖抗肿瘤活性的发现，至 20 世纪 50 年代，陆续发现一些真菌多糖和高等植物多糖具有明显的抑瘤活性。最近又发现许多中药多糖还具有降血糖作用。70 年代以来，科学家们发现多糖及糖复合物在生物体内不仅是作为能量资源和构成材料，重要的是它存在于一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的各种活动。多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分，广泛存在于动物、植物、和微生物细胞壁中，是生物体内除核酸和蛋白质以外的又一类重要的生物分子。科学研究已经确认糖类物质具有许多生物活性，包括抗肿瘤、免疫、降血糖和抗病毒等，而且对机体几乎无毒副作用。中药多糖因具有增强机体免疫功能及抗肿瘤降血糖等药理作用，而且几乎没有毒性与副作用，因此引起国内外药理学家、生物学家和化学家们的关注。1.多糖的提取工艺 1.1 水提法 用水作溶剂来提取多糖是最常用的方法之一，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提。水提取的多糖多数是中性多糖。一般植物多糖提取多数采用热水浸提法，该法所得多糖提取液可直接或离心除去不溶物；或者利用多糖不溶于高浓度乙醇的性质，用高浓度乙醇沉淀提纯多糖；但由于不同性质或不同相对分子质量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同，它也可以用于样品中不同多糖组分的分级分离；还可按多糖不同性质在粗分阶段利用混合溶剂提取法对植物中不同的多糖进行分离；其中，以乙醇沉淀最为普遍。 用 100g 去核枣粉，加入 250mL 适当体积分数的乙醇，45水浴回流脱脂两次，离心分离后枣渣加水共 3500mL，90水浴搅拌浸提8h，离心分离，合并所得多糖提取液；提取液 45减压浓缩，浓缩液用无水乙醇沉淀，离心分离，得粗多糖沉淀；粗多糖加水溶解后，氯仿、正丁醇脱蛋白，用 NaOH 溶液调 pH 值至弱碱性，加 0.4 倍多糖液体积的 H2O2，40水浴保温 4h 脱色；脱色液对蒸馏水透析24h，无水乙醇沉淀，离心分离，45真空干燥，得到大枣多糖。根据预实验，选择对水冷浸提取工艺有影响的主要因素：加水量、提取时间、提取次数及是否搅拌，按 L9（34）进行正交试验。按常规，将中药的水冷浸条件设为中间水平，分别再取高低两水平。最后得出枸杞多糖的最佳提取工艺为：取枸杞药材，第一次加水 l0 倍，以后每次加水 8 倍量，共冷浸 3 次；每次冷浸 1h；每小时搅拌 10min.溶剂提取为常用的传统方法之一，有自身的优点。如不需特殊设备，成本低等，但此法往往提取效率低且费时，因此，近年来，伴随着现代工业工程技术的迅猛发展，一些现代高新技术不断被应用到植物多糖的提取中。 1.2 酸提法 有些多糖适合用稀酸提取，并且能得到更高的提取率。将热水浸提过的阿魏侧耳子实体残渣加 8 倍量的 3%的三氯乙酸浸提，15过夜，过滤，离心，将提取液用 20%的 NaOH 中和至 pH 为 7，浓缩、醇析沉淀、丙酮洗涤、真空冷冻干燥得酸提水溶性粗多糖 PFA.从对海蒿子多糖的提取方法研究发现，从硫酸根含量及粗多糖产率看，酸提方法优于水提方法。 其具体酸提方法如下：取 100g 海蒿子干粉，加入1000ml0.1mol/LHCl 溶液提取，室温搅拌 1h 后过滤，重复操作三遍，合并滤液滤液减压浓缩至总体积的 1/5，再加入 95%乙醇至乙醇浓度达 30%，沉淀，离心除去沉淀中的褐藻酸。继续向上清液中加入乙醇至乙醇浓度达 70%，室温放置过夜使沉淀完全，离心，沉淀干燥得海蒿子粗多糖 C2.多次试验算得平均产率为 3.35%.在茜草多糖提取研究中，发现相对于水提，以稀酸提取茜草多糖，产品纯度较高。具体方法如下：茜草根粗粉 1000g，5%HC1 浸泡，离心，取上清液加入 EtOH 并调节至浓度为 70%，静置，2500rpm 离心，收集棕色沉淀物，95%EtOH 洗涤 3 次，以 4%HCl 溶解，加 1%活性炭脱色，真空抽滤，滤液过夜，弃去容器底部少许沉淀物，溶液置透析袋内，逆水法透析 3 日，冷冻干燥，得白色粉末约 10g（多糖 A） 。酸提法有其特殊性，只在一些特定的植物多糖提取中占有优势，报道的并不多。而且即使有优势，在操作上还应严格控制酸度，因为酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂。 1.3 碱提法 与酸提类似，有些多糖在碱液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。采用稀碱提取：多为 0.1mol/L 氢氧化钠、氢氧化钾，为防止多糖降解，常通以氮气或加入硼氢化钠或硼氢化钾。HayashiKatsuhiko 发明了从绿色藻类中提取酸性多糖的方法，而种多糖用常规的热水法是无法得到的。具体过程为：将干燥的绿藻粉末制成浮液，热水浸泡提取或将含水绿藻直接用热水提取后离心分离，取黏稠的固状物，加入碱水，在 pH3.0 的条件下再行搅拌提取，碱水提取液在搅拌的同时加入酸水调节 pH 值至34，静置沉降后离心得酸性多糖。同样，碱提优势也是因多糖类的不同而异。与酸提类似，碱提中碱的浓度也应得到有效控制，因为有些多糖在碱性较强时会水解。另外，稀酸、稀碱提取液应迅速中和或迅速透析，浓缩与醇析而获得多糖沉淀。分别称取 4 种动物材料 3 份，每份 50g，做平行实验：加 100mL0.1mol/LNaOH 溶液，在 60水浴中保温 24h，冷却后，用三氯乙酸调 pH 至 4 左右，6000r/min 离心 l5min，取上清液加 2 倍体积乙醇摇匀，出现絮状沉淀后静置，取沉淀加适量 90%乙醇振荡，静置，倒出上清液。用无水乙醇处理 2 次，过滤，沉淀再用无水乙醇洗 2 次，将沉淀摊于平皿上 50烘干，得粗品。粗品经糖含量、蛋白含量测定后，加入适量水重新溶解，加 0.5 倍体积酒精摇匀，静置片刻后，6000r/min离心 15min，除去蛋白杂质。上清液中再加入酒精，至乙醇体积分数约 60%，摇匀后静置，待沉淀后，小心将上清液倒出，沉淀中加入适量 90%酒精和无水乙醇 2 次脱水，过滤后沉淀再用无水乙醇洗2 次，摊于平皿上，50烘干，得到多糖精品。 1.4 超声提取法 超声波作为一种先进的提取方法，具有提取时间短、能耗低、效率高等特点，在生产中得到了广泛的应用。其主要原理就是超声波产生“空化作用” ，这种空化作用能够产生局部的高温高压，并形成强大的冲击波或高速射流，这种强大的高速射流能够有效地减小、消除与水相之间的阻滞层，加大了传质效率。同时，高速射流对植物细胞组织产生一种物理剪切力，使之变形、破裂并释放出内含物，这就大大加速了萃取过程。另外，超声波的许多次级效应如热效应、溶化、扩散、击碎、化学效应、生物效应、凝聚效应等也能加速植物有效成分在溶剂中的扩散释放，促进植物有效成分与溶剂混合，有利于萃取。 （1）分别称取 200g 青钱柳叶预处理原料，按原料与蒸馏水质量比为 1n10 加入蒸馏水，功率分别为 400、600、800、1000 和1200W 超声提取 40min，测定多糖的含量，平行试验 3 次。 （2）时间对青钱柳多糖得率的影响。分别取 200g 青钱柳叶预处理原料，用 1000W 功率，料液比为 1n10，超声时间分别为10，30，50 和 70min，测定多糖的含量，平行试验 3 次。料液比对青钱柳多糖得率的影响。分别称取 200g 青钱柳叶预处理原料，料液比分别为 1：8、1：10、1：15、1：20，用 1000W 超声功率提取，时间为 30min，测定多糖的含量，平行试验 3 次。通过比较发现在800W，50min 效果最好。超声处理可使南瓜多糖的提取时间缩短，在一定范围内随着超声波的使用功率的增大，提取所得的南瓜总糖、还原糖和多糖的产量也随之提高，温度与超声波可以协同作用，共同提高南瓜多糖的提取率。超声 60min 多糖得率及含量均最高，因此超声提取多糖的优化工艺为大枣渣加 40 倍体积水，超声60min，70%的乙醇沉淀。 1.5 微波提取 对微波技术的应用，近年来得到很大发展。微波是频率介于300MHz 和 300GHz 之间的电磁波，微波提取的原理是微射线辐射于溶剂并透过细胞壁到达细胞内部，由于溶剂及细胞液吸收微波能，细胞内部温度升高，压力增大，当压力超过细胞壁的承受能力时，细胞壁破裂，位于细胞内部的有效成份从细胞中释放出来，传递转移到溶剂周围被溶剂溶解。微波具有穿透力强、选择性高、加热效率高等特点。微波辐射（MWI）可以大大加快反应速度，缩短反应时间。微波技术应用于植物细胞破壁，有效地提高了收率。医学教育网收集整理对荔枝多糖用微波法进行了提取，荔枝干去壳核，60热水浸泡 20min.然后打浆，微波提取，浸提液趁热过滤，离心（5000r/min，15min） ，真空浓缩至原体积 1/4，用 95%酒精调至溶液乙醇含量为 80%，静置过夜，离心（5000r/min，10min） ，沉淀依次用适量 80%乙醇、无水乙醇洗两遍，真空冷冻干燥得荔枝粗多糖。在微波浸提与热水浸提比较的基础上，进行了紫菜多糖微波提取工艺正交优化试验和微波不同提取方式对紫菜多糖提取率的影响研究。结果表明：微波提取优于热水提取，微波冻融提取效果最佳，提取率最高达 7.45%，而热水提取率为 2.05%.影响微波浸提的主要因素为浸提时间，其次是微波功率和液固质量比。优选方案为微波功率200W、提取时间 8min、水与紫菜液固质量比 40n1.真空冷冻干燥紫菜多糖质量明显优于减压热风干燥和常压热风干燥。微波提取法具有提取时间短，提取率高，是强化固液提取过程颇具发展潜力的新型辅助提取技术。 1.6 超滤法 膜分离技术被公认为现代分离技术领域中最先进的技术之一，已广泛应用于化工、电子、环保、医药等领域。超滤（Ultrafiltration，UF）是膜分离科学的重要分支，其原理是以选择性透过膜为分离介质，在外界压力作用下，原料组分选择性地透过膜，以达到分离、提纯的目的。将超滤膜用于多糖这种生物活性物质的分离，不损害活性、分离效率高、能耗低、设备简单、可连续生产、无污染等。 2.多糖的分离和纯化 2.1 分级沉淀法 分步沉淀法是根据不同多糖在不同浓度低级醇、酮中具有不同溶解度的性质，从小到大按比例加入甲醇或乙醇或丙酮进行分步沉淀。盐析法是根据不同多糖在不同盐浓度中溶解度不同而将其分离的一种方法。常用的盐析剂有氯化钠、氯化钾、硫酸铵等，以硫酸铵最佳。金属络合物法是利用多糖能与铜、钡、钙、铅离子形成络合物而沉淀。常用的络合剂有斐林试剂、氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等。季胺氢氧化物是一类乳化剂，与酸性多糖形成不溶性化合物，常用于分离酸性多糖。一般地说，酸性强或相对分子质量大的多糖首先沉淀出来，所以控制季胺盐的浓度能分离各种不同的酸性多糖。安络小皮伞粗多糖的纯化方法，在多糖溶液中加入不同浓度乙醇溶液，得到多个多糖；天门冬冷水浸提物采用丙酮分级沉淀法得到 3种多糖。 2.2 柱层析法 凝胶柱层析法常用的凝胶有葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose） ，以不浓度的盐溶液和缓冲溶液作为洗脱剂，从而使不同大小的多糖分子得到分离纯化，但不适宜粘多糖的分离。一般生药提取物得以分离多用 Sepharose、DEAEToyopearl、Sephacryl、Sepha2dex 精致得到各种多糖。如灵芝多糖、附子多糖、白术多糖、山药多糖等。医学教育网搜集整理纤维素阴离子交换剂柱层析法常用的交换剂为 DEAE-纤维素和 ECTEOLA-纤维素，分类硼砂型和碱型两种，洗脱剂可用不同浓度碱溶液、硼砂溶液、盐溶液，其优点可吸附杂质、纯化多糖，并适用于分离各种酸性、中性多糖和粘多糖。如百合多糖、北沙参多糖、太子参多糖等。 2.3 其他方法 透析、超滤及超速离心选用不同规格的超滤膜和透析袋进行超滤和透析以及一定条件下的超速离心操作，可按分子大小将多糖样品分级，超滤和透析更常用于除去小分子物质。区带电泳主要按多糖的电荷性质不同分级，常用的有聚丙烯酰胺凝胶电泳，乙酸纤维素薄膜电泳。 3.小结 多糖广泛地存在于动物细胞膜、植物和微生物细胞壁中，植物中更是广泛的含有多糖，而中药大部分都是植物药，有不少中药中的多糖成分的药理作用都是其重要的主要功效之一。医学教育网搜集整理很早以前，人们就采用一些含多糖丰富的植物治疗各种疾病。近二十多年来，随着分子生物学的发展，人们逐渐认识到糖及其复合物分子具有极其重要的生物功能。因此，多糖的提取和分离技术的研究和发展就显得尤为重要。 金针菇多糖的提取方法金针菇Flammulina velutip (Fr)Sing-, 担子菌目金钱菌属,又名冬菇,朴菰,金菇等,其子实体含蛋白31.2 ,脂肪5.8 及维生素B ,B., C,PP(生物素),含1O余种氨基酸,已广泛的应用到食品,调味品行业中,其提取物(主要成分为多糖,糖白，蛋白聚糖,朴菰素等)对小白鼠肉瘤 180的抑制率达81.1 “-100 ,对艾氏腹水癌的 抑制率达80 1,具有很好的药用价值L2 .多糖的提取,目前主要有水提醇析法,膜分离法,微波 法等“ ,而超声法提取报道甚少.笔者对金针菇多糖的提取工及条件进行了研究,并利用超声波对金针菇多糖的提取进行了探讨。. 1材料与方法 1.1实验材料 市售质优金针菇鲜品. 1.2试剂和仪器 试剂:CHCl3, 一CH90H,C2H50H,HC1, H2SO.,NaOH,C H50H等纯度均为A.R. 仪器:722一光栅分光光度计,上海第三分析仪器厂生产;TDL一40B离心机,上海安亭科学仪器厂生产;PHS一2c型精密酸度计,上海精科雷磁生产;HS一250D超声波仪(27 kHz,250 w),宁波仪器三厂生产;,DT一100单盘分析天平,北京光学 仪器厂生产. 1.3 多糖总量测定采用苯酚一硫酸法 ,以葡萄糖为标准品. 制作标准曲线:准确称取25 mg葡萄于 250 mL容量瓶中加水至刻度线,摇匀,然后分别 吸取0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL于6支干燥试管中,各以水补至2.0 mL然后缓慢地加入6ml的苯酚液1.0 mL及5.0 mL浓H2SO.,静置1O min,摇匀,室温放置20 rain,于490 nm测其吸收值,以2.0 mL蒸馏水为空白液,实验测定结果列入表1. 表1葡萄糖标准曲线的测定,以浓度对吸收度回归得方程: A=0.008 395+7.144 7C; 此式r=0.999 2.其中A为吸光度,C为浓度. 1.4流程工艺 原料一烘干一称重一匀浆一调配一热水抽提 一离心分离一滤液醇析一复溶一去除杂蛋白一真空浓缩一干燥一产品. 2结果与讨论 2.1金针菇多糖提取