检验中级考试小结

最深刻的脚步留在最泥泞的路上！天明精心制作1临床检验基础1、血液检验真空采血管 灰色-氟化钠、草酸钾抗凝-测定血糖金黄色-分离胶血涂片制备技术：血滴越大、角度越大、推片速度越快则血膜越厚。进行红细胞渗透脆性试验时使用的抗凝剂为肝素凝血项目使用 109mmol/l 枸橼酸钠抗凝，抗凝剂与血液比例 1:9。血沉用枸橼酸钠抗凝，抗凝剂与血液比例 1:4。1.血细胞手工检验（1）血细胞形态嗜多色红细胞属于未完全成熟的红细胞，由于胞质中含有 RNA 而被染成灰色、蓝色，嗜多色性红细胞增多提示骨髓造红细胞功能活跃，常见于溶血性贫血。H-J 小体位于成熟或幼红细胞胞质中，是保内残留的 RNA，常见于巨幼细胞性贫血、溶血性贫血及脾切除术后。点彩红细胞见于铅中毒、溶血性贫血患者等。 卡波环出现原因是核膜残余物或胞质脂蛋白变性。Russell 小体是浆细胞胞质内的一种数目不等、大小不一、染成肉红色的球形小体，是浆细胞内质网分泌免疫球蛋白受阻或黏蛋白变性所致，常见于多发性骨髓瘤、伤寒、疟疾。粒细胞自晚幼粒开始失去分裂能力，逐渐发育成熟。涂片法白细胞分类时，涂片尾部幼稚细胞多中性粒细胞增多并核左移称再生性左移，常见于各种病原体的感染，特别是急性化脓性细菌感染。核左移伴中性粒细胞减少或者正常称为退行性核左移，多见于机体抵抗力低下的严重感染，常见于伤寒感染。杆状粒细胞5%称轻度左移10% 中度25%并出现幼稚粒细胞时成为重度核左移（2）血细胞计数血细胞计数板手工计数白细胞 四角大方格 N/4*10*106*稀释倍数红细胞、血小板 中央大方格中的四角+中央中方格 N*5*10*106*稀释倍数嗜酸性粒细胞、精子 10 个大方格 N*106*稀释倍数*计数域的误差属于固有误差，无法避免，不属于技术性误差。Miller 窥盘计数 Ret 大、小方格面积比为 9:1小方格计数红细胞数，大方格计数网织红细胞数。少儿在 6-9 天和 4-5 岁时，外周血淋巴细胞与中性粒细胞基本相等约为 50%。正常人外周血涂片中，中性杆状粒细胞比例为 1-5%。最深刻的脚步留在最泥泞的路上！天明精心制作2HCT 测定 WHO 推荐的首选常规方法为微量离心管，经典方法-温氏法。温氏法血细胞比容测定，EDTA-K2 抗凝血加入温氏管中离心后血液分为 5 层，自上而下分别为血浆层、血小板层、白细胞层和有核红细胞层、还原红细胞层、帯氧红细胞层。读数时读取还原红细胞层柱高即为血细胞比容。典型 MCHC 增高仅见于球形红细胞增多症，但罕见超过 380g/l。巨幼细胞性贫血直方图波峰右移，峰底增宽，明显的大细胞不均一性。缺铁性贫血时 RDW 最早出现变化。嗜酸性粒细胞稀释液中乙醇、丙酮、乙二醇等作用为嗜酸性粒细胞保护剂，伊红、固绿等为嗜酸性粒细胞着色剂，甘油可以防止乙醇等液体挥发，碳酸钾、草酸铵可破坏其他细胞和增强嗜酸性粒细胞着色。嗜酸性粒细胞计数结果可应用于观察急性传染病的预后、判断肾上腺皮质功能、观察大手术患者和烧伤患者的预后。猩红热急性期，可能乙型溶血性链球菌产生酶激活补体，引起嗜酸性粒细胞增多。血沉减慢见于红细胞数量明显增多以及纤维蛋白原含量下降。红细胞渗透脆性试验多用于红细胞膜缺陷筛查，对遗传性球形红细胞增多症具有重要诊断价值。Ham 试验对诊断 PNH 有重要价值。Coombs 试验对免疫性溶血性贫血有重要诊断价值。血红蛋白电泳对异常血红蛋白病有重要诊断价值。纤维蛋白原、球蛋白、CM、胆固醇等升高均加快血沉；清蛋白、卵磷脂增加能减缓红细胞沉降率。正常人血浆比密约为 1.025-1.030。浓缩血小板在 20-24 度温度下，保存期为 7 天。再生障碍性贫血中 MPV 降低2.血细胞分析仪国际血液学标准化委员会公布的血细胞分析仪的性能评价指标：可比性、准确性、总重复性、精密度、线性范围。血细胞计数参考方法：红细胞、白细胞计数参考方法为单通道电阻抗法；血小板为流式细胞仪。网织红细胞生成指数（RPI）=网织红细胞计数（% ）*（患者 HCT/正常人 HCT）*（1/网织红细胞成熟天数） ，反映的是网织红细胞生成速度是正常人的多少倍。使用血细胞分析仪计数网织红细胞时，血小板聚集可引起假性升高。Hb 测定：1.ICSH 推荐参考方法- 氰化高铁血红蛋白比色法：高铁氰化钾将各种血红蛋白转化为高铁血红蛋白（SHb 除外，无法转化 SHb） ，而后与 CN-结合成 HiCN，最大吸收峰 540nm，转化液推荐使用文- 齐液。试剂保存不得使用塑料瓶，可冷藏，不可冰冻，因前两者均会造成 CN-丢失造成 HB 转化不完全，测定结果偏低。缺点：试剂有毒；SHb 无法转化为氰化高铁血红蛋白。2.SDS-Hb 法 无公害最深刻的脚步留在最泥泞的路上！天明精心制作3血细胞分析仪采用多角度偏振光散射法（MAPSS）测定时：1、0 度前角光散射可粗略测定细胞大小；2、10 度狭角光散射可测定细胞内部结构相对特征 3、90 度垂直光散射测定细胞内部颗粒和核分叶情况；4、90 度垂直去偏振散射光区分中粒与嗜酸粒。激光与细胞化学法即应用激光散射与细胞化学法进行白细胞分类过氧化物酶活性：嗜酸性粒细胞中性粒细胞单核淋巴、嗜碱性粒细胞=0激光散射法血小板计数时，高角度（5 -10）主要检测细胞折射指数；低角度（2-3 ）主要测量细胞大小。电阻抗法血小板计数时采用浮动界标技术。电阻抗、射频及特殊染色法进行血细胞分类时，检测幼稚细胞加入硫化氨基酸，幼稚细胞结合更多硫化氨基酸，因此幼稚细胞对溶血剂有抵抗作用，成熟细胞随后被破坏。3.血型检验卫生部要求：抗 A、抗 B 效价128，亲和力15s，凝集素效价1:4，必须具有检出A2、A2B 的能力。Rh 血型阴性确证应做弱 D 鉴定，弱 D 抗原较弱一般不与盐水中抗 D 试剂反应凝聚，必须采用酶法、抗球蛋白法、凝集胺试验等检测。低离子凝聚胺技术对 kell 血型系统中的抗 K 不敏感。简易致敏红细胞血小板血清试验是检测血小板血型较为理想的方法。ABO 血型 4 种表现型、6 种基因型ABO 基因位于 9 号染色体短臂ABO 基因中 B 编码的糖基转移酶是 D-半乳糖转移酶，A 编码的是 N-乙酰-D- 半乳糖转移酶。血型物质不存在于脑脊液中RH 抗原目前仅发现在红细胞上存在，血小板表面存在血小板特异抗原以及 ABO、HLA等相关抗原。患者红细胞直接抗人球蛋白试验阳性可以导致 Rh 血型鉴定出现假阳性。孟买血型基因型为 hh，但 h 基因为无效基因，其红细胞表面无 A、B、H 抗原，血清中含有抗 A、抗 B、抗 H 抗体。稀有血型血液保存方式一般选用冷冻红细胞。引起非溶血性发热反应最常见的原因是抗白细胞抗原的抗体，因此可用少白红细胞预防非溶血性发热反应。为预防 TA-GVHD，临床选用辐照红细胞，破坏免疫活性淋巴细胞。选用洗涤红细胞来预防因输血发生的严重过敏反应。输注全血补充血小板时 12h 内的全血视为新鲜血；补充粒细胞时 8h 内全血视为新鲜血；补充凝血因子时 24h 内全血视为新鲜血。用酶处理过的红细胞进行血型鉴定时，MN 抗原会被破坏。最深刻的脚步留在最泥泞的路上！天明精心制作42、尿液检验：1.尿液理化检验甲醛对尿中细胞、管型有固定作用，用于 Addis 计数防腐甲苯可在尿液表面形成一层薄膜，常用于尿糖、尿肌酐、蛋白等化学成分测定防腐；浓盐酸用于 17 羟、17 酮类固醇激素测定的防腐；冰乙酸用于 24H 尿醛固酮测定的防腐。痰液观察分层情况，可用少量苯酚防腐。正常人尿液中 GLU 含量为 5.0mmol/24h尿液 T-H 蛋白紫外光谱分析出现最大吸收峰的波长为 277nm尿本周蛋白检测：筛选方法-热沉淀- 溶解法、对甲苯磺酸法确诊方法 SDS-PAGE、免疫电泳、免疫固定电泳本周蛋白的本质是免疫球蛋白轻链。肾小管重吸收功能受损多为小分子蛋白尿，肾病综合征多为选择性蛋白尿。重金属中毒多引起肾间质性肾炎，主要表现为肾小管损伤，重吸收与浓缩功能减退。Mb 蛋白尿的特点 Mb 能溶于 80%饱和硫酸铵溶液正常人尿胆红素阴性，尿胆原阴性或弱阳性。苯丙酮酸尿症患者新鲜尿液具有“老鼠屎”样臭味。尿胆原测定常用 Ehrlich 法，苯丙酮酸尿症的筛查试验为三氯化铁定性法，酪氨酸尿的过筛试验为亚硝基萘酚定性法。加热乙酸法测定本周蛋白尿 PH 要求为 4.5-5.5。2.尿沉渣检验肾移植后发生排斥反应尿液细胞学检查改变：核退变，红细胞、白细胞、上皮细胞形成混合细胞团块，淋巴细胞，肾小管细胞，管型和背景坏死物。其中两项恒定指征为淋巴细胞和肾小管细胞。人巨细胞病毒感染，尿液中含有巨细胞病毒包涵体的细胞是上皮细胞。尿管型显微镜检查应在低倍镜下观察 20 个视野，正常人尿液检查 RBC0-3/HP，WBC0-5/HP。Addis 1h 尿白细胞计数，正常女性白细胞 14 万/小时。正常人尿渗量为 600-1000mOsm/(Kg H2O)3.尿液分析仪检验干化学法中，高浓度尿蛋白可使尿比重测定偏高；Vc 可尿糖测定假阴性；青霉素药物偏酸可使尿蛋白测定假阴性；青霉素类药物可使尿白细胞测定减少或假阴性；Vc 可使尿隐血试验假阴性。干化学法测定尿胆原时，胆色素原、胆红素、吲哚、吩噻嗪类都可产生干扰；大多数尿液试剂带没有测定尿胆原阴性，因此干化学不能用于梗阻性黄疸尿胆原测定。干化学法测定尿胆红素时，维生素 C、亚硝酸盐、氯丙嗪、盐酸苯偶氮吡啶都可产生干扰。CCCLS 规定：干化学法的确证实验 尿蛋白确证实验-磺基水杨酸法；尿葡萄糖确证实最深刻的脚步留在最泥泞的路上！天明精心制作5验-葡萄糖氧化酶定量法；尿胆红素确证实验-Harrison 法；尿白细胞和红细胞-镜检；尿比重- 折射仪法三、排泄物与分泌物检验1.粪便检验：检查钩虫卵用饱和盐水漂浮法，蛲虫卵用透明膜试纸法，蛔虫卵用离心沉淀集卵法，血吸虫卵用毛蚴孵化法；阿米巴滋养体直接镜检大便镜检到巨噬细胞常见于急性菌痢。消化道出血50ml 开始出现黑便，粪便隐血阳性消化道出血 5ml 左右。消化道寄生虫虫卵中体积最小的是华支睾吸虫卵。艾滋病相关性腹泻，由寄生虫引起腹泻最常见的是隐孢子虫。2.阴道分泌物检验：BV 的常见病原体是阴道加德纳菌，患者白带性状多为奶油状，含大量粘液与中性粒细胞。诊断加德纳菌性阴道炎的指标是：1.线索细胞；2.分泌物 PH4.5；3.胺试验阳性；4.阴道分泌物稀薄均匀。阴道正常 PH 为 4.0-4.5四、体腔液检验1.脑脊液检验：脑脊液蛋白质定量比色法优于比浊法，正常人脑脊液中蛋白质含量不到血浆蛋白的1%；Froin 综合征是一种梗阻性脑病；潘氏实验灵敏度高，部分正常脑脊液可以呈极弱阳性。脑脊液蛋白电泳有前清蛋白带，血清蛋白电泳一般无前清蛋白带。化脓性脑膜炎 LDH 明显增高，经治疗， LDH 无明显减低甚至进一步增高，提示预后不好。结核性脑膜炎 ADA 增高明显，多发性硬化症脑脊液中髓鞘碱性蛋白 MBP 含量上升，MBP 可以作为多发性硬化症的辅助诊断指标。正常人脑脊液无红细胞，白细胞(0-10)*10 6 主要是淋巴与单核细胞。化脓性脑膜炎，脑脊液明显浑浊，静置后可形成凝块或沉淀；结核性脑膜炎，脑脊液毛玻璃样轻度浑浊，静置后表面可有网膜形成；蛛网膜下腔梗阻，脑脊液可呈黄色胶冻样。脑脊液同时出现胶样凝固、黄变症和蛋白质-细胞分离，称为 Froin-Nonne 综合征，是蛛网膜下腔梗阻的特点。正常人脑脊液压力为 80-180mmH2O，健康人腰穿所得脑脊液比密为 1.006-1.008，正常人脑脊液 PH 为 7.31-7.34。2.浆膜腔积液检验：引起胸腔积液最常见的恶性肿瘤是肺癌，以周围型肺癌常见。恶性间皮瘤染色质分布于核的一侧，病理性核分裂象多见，多核瘤细胞多见。小细胞未分化癌特征性表现-癌细胞体积小、胞质少、裸核样，核染色深呈墨水滴样。最深刻的脚步留在最泥泞的路上！天明精心制作6心包积液草黄色常见于尿毒症引起的心包积液，黄色多见于黄疸。胸腔积液中最常见的肺癌细胞类型为腺癌女性腹水常见类型为浆液性乳头状囊腺癌3.关节积液检验：类风湿患者关节积液中可发现胆固醇结晶RA 主要累及小关节、肿大僵硬；关节腔积液白细胞5000*10 6 葡萄糖不明显降低。化脓性关节炎时 WBC6000*10 6 葡萄糖明显降低。正常人关节积液 WBC（0-50）*10 6 /L。4.羊水检验：粘多糖沉积病产前诊断简易指标是羊水细胞内甲苯胺蓝定性试验和糖醛酸半定量测定，胰腺纤维囊性病产前诊断最佳指标是羊水 r-谷氨酰转移酶测定五、脱落细胞学检验：绝经期妇女阴道涂片中可见到阴道上皮高度萎缩，细胞出现退化现象，核染色质疏松或消失，称为“早熟角化细胞” 。挖空细胞特指 HPV 感染出现的核周空穴细胞；瓢形核是产后性外底层细胞的特征；核内包涵体多见于 HSV 病毒感染，印戒细胞是胃腺癌的一种细胞。宫颈癌以鳞状细胞癌为主，脱落细胞中找到挖空细胞应做 HPV 分型或活检。宫颈鳞癌以非角质化型常见。支气管肺泡灌洗液，结节病时以 T 淋巴细胞为主；特发性肺间质纤维化以中性粒细胞增多为主，伴嗜酸粒增多；卡氏肺孢子虫感染时，以淋巴细胞增多为主；急性呼吸窘迫综合征以中性粒细胞为主。判断细胞良性或恶性，主要依靠细胞核的改变判断细胞分化倾向主要依靠细胞质的改变最深刻的脚步留在最泥泞的路上！天明精心制作7临床免疫学检验1、免疫分子及其检测（1）抗原抗体抗原制备：颗粒性抗原可溶性抗原：组织和细胞破碎，抗原粗提，而后是抗 1、抗原抗体反应与制备 原提纯（超速离心、选择性沉淀、层析、电泳法）免疫球蛋白片段与人工抗原制备抗体制备：多抗（纯化-SPA 与 IgG 结合亲和层析、鉴定） 单抗制备基因工程抗体木瓜蛋白酶可以将 IgG 裂解成一个 Fc 和两个 Fab 片段胃蛋白酶将 IgG 裂解成 F(ab)2 与小肽片段。制备单抗隆抗体时常用的细胞融合剂是 PEG1000-2000。基因工程抗体较于杂交瘤单抗隆抗体最重要特点：非异源性免疫球蛋白分型依据是 CL 抗原性不同进行分类PEG 沉淀法或比浊法常用于检测 CIC，简单易行，但特异性差；常用 PEG 最终浓度为 3-4%，PEG 沉淀试验不能反映小分子循环免疫复合物， 2%只能沉淀大分子， 5%选择性沉淀 CIC 的能力消失。PEG 沉淀法中 PH、离子强度等条件固定时，蛋白质分子量越大，所用 PEG 浓度越小，分离血清免疫复合物一般采用 PEG6000。补体参与检测 CIC 方法包括 C1q 固相法、抗 C3-CIC-ELISA 法，由于 IgA 不能结合补体，所以补体参与检测 CIC 法不能检测 IgA 抗体。离子种类对免疫复合物形成速度的影响：H 2P04-SO42-NO3-CLO4-SCN-单克隆抗体的特异性取决于克隆细胞的筛选免疫监视功能-肿瘤发生免疫自稳功能-自身免疫病2、抗原抗体反应类型：凝集与沉淀反应（1）凝集反应最深刻的脚步留在最泥泞的路上！天明精心制作8RF 采用散射比浊法检测的主要是 IgM胶乳凝集试验所用载体多为 0.8um 聚苯乙烯胶乳，（2）沉淀反应免疫散射比浊中，颗粒直径远小于入射波长时，则散射光分布比较均匀，称为 Ray-leigh 散射。若颗粒直径接近或大于入射波长时，则散射光分布不均匀，称为 Mie 散射。介于两者之间，则称为 Rayleigh-Mie 散射。速率散射比浊中，加入 PEG 的目的是加速抗原抗体复合物的形成，缩短反应时间，常用PEG8000。速率散射比浊免疫分析是抗原抗体结合反应的动态测定。速率散射比浊法，为避免出现后带现象，常使抗体过量；此外还加入了抗原过量检测系统，反应后再加入适量抗原，若出现第二峰信号，则提示第一峰信号均由待测抗原产生且结果可靠；若未出现第二峰信号提示待测抗原过量。火箭免疫电泳作为抗原定量只能测定 ug/ml单向扩散试验若应用多克隆抗体测量 M 蛋白时，测定会偏高？双向扩散试验试管法先后加入试管的是：含抗体的琼脂、普通琼脂、含抗原的琼脂。目前临床检验中不推荐使用对流免疫电泳与火箭免疫电泳，共同原因是电泳载体的电渗作用？火箭免疫电泳结合放射自显影技术灵敏度可提升 1000 倍CIEP counter immunnoelectrophoresisRIE rocket immunoelectrophoresisIEP immunoelectrophoresisIFE immunofixation electrophoresis对流免疫电泳中 IgG 抗体四个亚型表现不同， IgG1 和 IgG2 由于电渗作用向阴极移动，而IgG3 和 IgG4 向阳极移动。化学交联法常用炭化二亚胺将胶乳上的羟基与被交联物上的氨基缩合在一起包被过程中最常用的缓冲液为 PH9.6 PBS3、标记免疫技术（1）荧光免疫技术FITC 激发光 490-495nm 发射光 520-530nm 黄绿色荧光RB200 570nm 600nm 橘红色荧光TRITC 550nm 620nm 橙红色荧光，适合与 FITC 配对双标记PE 490nm 595nm 红色 ，多与 FITC 用于流式细胞仪双标荧光抗体效价常用倍比稀释，非特异性染色最弱的稀释度作为其效价；若采用琼脂双扩散法测定，荧光抗体效价需大于 1:16.荧光抗体染色技术中直接法较其他方法特异性高、非特异性染色少。FITC 在酸性溶液中荧光强度显著降低荧光素标记抗体的鉴定：抗体效价（抗体活性） 、荧光素和蛋白质结合比（F/P ） 。F/P 越高，说明抗体上结合的荧光素越多，反之越少。一般用于固定标本的抗体 F/P=1.5 左右，用于活细胞染色 F/P=2.4 为宜。荧光偏振免疫测定主要用于测定小分子抗原，是临床药物浓度检测的首选方法；缺点是不最深刻的脚步留在最泥泞的路上！天明精心制作9适用于大分子物质。（2）放射免疫技术RIA 为标记抗原竞争法测定抗原；IRMA 分为直接和双抗体夹心法均为标记抗体测定抗原。125I 衰变产生 r 射线， 3H 衰变产生的是 射线比放射性是指单位质量标记物的放射强度，常用 Bq/ug，Ci/g 或 Ci/mol 表示，一般标记抗原的比放射性越高，试验灵敏度高。放射化学纯度是指结合于抗原上的放射强度占总放射强度的百分率，一般要求95%放免技术中滴度常采用一株抗血清做系列稀释后再与标记抗原反应。（3）酶免疫技术（4）化学发光免疫分析技术发光免疫分析根据化学反应不同可以分为三类：1、直接参与发光反应 ，如吖啶酯类标记物2、以发光酶标记，如 AP；3、以能量传递参与氧化还原反应的非酶标记物，如三联吡啶钌标记物。（5）胶体金免疫技术（6）免疫组化免疫复合物与游离标记物分离的方法：1、活性炭吸附法主要用于测定小分子抗原或药物。（2）补体及检测CRP、甘露糖结合凝集素（MBL）与 IgM、IgG1/2/3 免疫复合物可以激活补体经典途径，而凝集的 Ig、病原微生物（内毒素等）可以激活补体替代途径。补体结合试验含三个系统：反应系统、补体系统、指示系统。有五种成分参与：已知抗体、待测抗原、绵羊红细胞、溶血素、补体。若标本中无待测抗原，则已知抗体与溶血素-绵阳红细胞结合，激活补体，产生溶血作用，若标本中含待测抗原，则抗体与抗原结合，不产生溶血现象。补体成分测定： CH50 测定经典途径总补体活性，免疫溶血法测定的是单个补体的活性；补体结合试验是用于检测某种抗原或者抗体，火箭免疫电泳可用于测定单个补体的含量。血清补体 C3 含量最高，C2 含量最低抗体与相应抗原结合后，CH2 补体结合位点暴露出来才能激活补体。补体激活后 C2b 裂解为小片段。补体参与的溶血试验应使用 2 个单位的溶血素，CH50 法测定的是总补体活性，单位 U/ml经典途径激活补体的 IC，可以用 C1q 结合试验来测定。（3）细胞因子及其受体检测最深刻的脚步留在最泥泞的路上！天明精心制作