基因敲除与高表达、细胞培养技术(简明版)

1、基因高表达利用高表达质粒载体pCaEXP 通过基因同源重组方法构建SODs基因高表达的VX2瘤株肝癌模型。一、材料、试剂和仪器高表达质粒载体pCaEXP，大肠杆菌，培养基（按配方配制酵母浸膏蛋白胨葡萄糖培养基）， 限制性内切酶; Pyrobest DNA olymerase、DNA Marker DL2000、Goldview 核酸染料， 质粒DNA小量抽提试剂盒、PC产物纯化试剂盒，琼脂糖，小量酵母菌总NA 抽提试剂盒，eal Time T-PC 所用试剂;eal Time PC仪，F-200 紫外与可见分析装置，电泳槽， 高速冷冻离心机，恒温振荡培养箱。二、方法步骤为了实现SODs基因的高

2、表达，将SODs基因完整开放阅读框( OF) 连接于高表达质粒载体pCaEXP中MET3 启动子的后面，以实现MET3 对SODs 基因OF 的控制。1、首先用基因组抽提试剂盒抽提SODs基因组，在SODs基因组中用含有Bam H和Pst酶切位点的引物P1和P2扩增SODs基因OF 全长。2、使用上述两个酶分别酶切SODs基因的OF 和pCaEXP 质粒，酶切产物纯化后使用T4 DNA ligase 进行连接。将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5，在含氨苄青霉素的LB固体培养基上进行筛选，挑取阳性克隆扩增后采用质粒抽提试剂盒小量抽提质粒，然后对所抽提的高表达质粒载体pCaEXP-SPE 1 采用

3、酶切方法进行鉴定。基因敲除基因敲除兔肝癌模型制备，方法有很多种，如传统ES打靶、TALEN、CRISPR/Cas9，还有TetraOneTM基因敲除。以CRISPR/Cas9技术为例：一、材料、试剂和仪器sgRNA; UCA试剂盒（对sgRNA/Cas9进行活性检测），质粒载体，sgRNA/Cas9 mRNA，PCR试剂盒，其他常规试剂；全自动生化分析仪，微量移液器，电热恒温水浴箱，超净工作台，凝胶图像扫描仪，微波炉，混匀器，离心机，生物显微镜。二、方法步骤EGE技术（基于Crispr cas9技术）1.设计构建识别靶序列的sgRNA;2.设计构建致靶基因切割的EGE系统载体质粒；3.利用UC

4、A试剂盒对sgRNA/Cas9进行活性检测；4.设计构建打靶载体；5.体外转录sgRNA/Cas9 mRNA;6.兔肝癌原核注射sgRNA/Cas9 mRNA和打靶载体；7.获得Fo代兔，利用PCR对Fo代兔进行基因型鉴定；8.获得F1代兔，利用PCR和southern blot杂交技术对F1代兔进行基因型鉴定。细胞培养一、材料、试剂和仪器主要仪器与试剂匀胶机，光刻机，体视显微镜，倒置荧光显微镜，等离子键合机，酶标仪，图像处理软件，CO2培养箱，水浴锅，灌流泵，大容量离心机，超净工作台， 移液器等；海藻酸钠， 氯化钙，柠檬酸钠，荧光素钠，胰蛋白酶，小牛血清， RPMI-1640 培养基,胰蛋白

5、酶，L-谷氨酰胺SU-8 光刻胶及显影液，Sylgard184 型聚二甲基硅氧烷，染色剂，以及青霉素与链霉素。二、方法步骤HBSS溶液: 取HBSS 47. 5 m L,分别加入0. 5 mol / L EGTA0. 05 m L和1 mol / L HEPES2. 5 m L,充分均匀,4 保存备用。SFM培养液: 取RPMI-1640培养基45 m L,分别加入50 g / m L青链霉素0. 5 m L,10 mg /m L链霉素0. 25 m L,灭活小牛血清5 m L,200 mmol/L L-谷氨酰胺0. 5 m L,充分混匀备用。 (1) 将细胞接种于培养皿中。37,5% CO2培养箱中培养2 h( 或过夜,12 16 h) 。(2)