外周血基因突变检测进展

1、外周血基因突变检测进展复旦大学附属肿瘤医院病理科周晓燕2015-08-30上海主要内容 为什么要尝试外周血基因突变检测？ 采用的方法有哪些？ 外周血ctDNA与组织中突变的比较 ctDNA突变与临床分期和疗效的关系 ctDNA突变检测的临床价值 病理科是否应参与？ 为何尝试外周血检测？晚期肺癌重检的比例10.90.80.70.60.50.40.30.20.1066.30%（ N=122） 无法取得活检者 疾病的进展的监测？病人数：N=184年性龄 ：64.6（20.8-86.9） 别：M=104；F=8020.10%（ N=37）11.40%2.20% (N=4)（ N=21）（克里夫兰 的临

2、床经验）血液标本的检测对象CTCCrowley E, Di Nicolantonio F, Loupakis F, Bardelli A. Nat Rev Clin Oncol. 2013 Aug;10(8):472-84.Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood.circulating tumor cell，即循环肿瘤细 胞，指释放到外周血中的肿瘤细胞，目前CTC的捕获比较困难 即 血 浆 circulating tumor DNA，即循环肿瘤DNA ，指由肿瘤细胞释放到血液循环系统中的DNAcell free DNA，游离

3、DNA，是外周血中一种细胞外呈游离状态的小片段核酸，即cfDNA包含了ctDNAct DNAcf DNA液态活检的可能性外周血游离DNA(cfDNA）由凋亡和坏死的肿瘤细胞产 生，其遗传学特性与肿瘤基因组DNA相似。 cfDNA特点： 1. cfDNA在血浆中浓度变动大 (10- 1200ng/mL)2. cfDN段很短(180bp)3. 肿瘤释放的cfDNA在总cfDNA中的含量不稳定 (3%-93%)存在缺陷，但可作为补充cfDNA的特点及解决方案 总量少 10%Fraction of EGFR mutant in total cfDNATaniguchi et. al., Clin Ca

4、ncer Res (2011)Number of samples (%)Number of EGFR M+ plasma samplesFrequencyctDNA丰度低1.高灵敏度的检测方法片段小1. 增加血量2. 专用的血液DNA提取试剂盒总量少Bettegowda C et al. Sci Trans Med 2014;6(224)检测方法荧光PCRDigtal PCR二代测序。ARMS652位未经TKI治疗的NSCLC患者(高加索人)肿瘤组织与血液检测结果对比：86位未经TKI治疗的NSCLC患者(中国)肿瘤组织与血液检测结果对比：65.7%99.8%94.3%敏感性:特异性:一致率:

5、64.9%100%84.9%敏感性:特异性:一致率:Liu X, et. al. J Clin Path (2013).血浆肿瘤组织总计+-+24024-134962总计374986血浆肿瘤组织总计+-+69170-36546582总结105547652IFUM研究：血液检测阳性可以指导TKI用药 IVIFUM(易瑞沙后续评估)研究中，652例患者中血液与配对组织EGFR突变状态的一致性是94.3%12010080604020099.8 10099.894.3 96.5 97.965.7 67.6 61.8所有突变19缺失L858R一致性灵敏度特异性对于无法获取组织样本或者组织样本量不足以检测

6、的患者， 可选择血液ctDNA用于评价EGFR突变状态Jan YD, et al. 2014 ASCO Abstract 1868.IFUM研究：血液检测阳性可以指导TKI用药 IVIFUM(易瑞沙后续评估)研究中，血液与配对组织不同EGFR突变状态患者ORR的一致，19外显子缺失患者PFS也一致(10.3月 vs 9.6月)100所有突变19缺失L858R突变所有突变类型19缺失82.210.376.910.48010.272.569.86563.610.260109.79.8409.69.6209.49.20组织血液组织血液Jan YD, et al. 2014 ASCO Abstract

7、 1868.ORR(%)PFS (月)两种检测方法的比较 AZD 9291 StudyThress et al., ASCO 2014两种检测方法的比较 AZD 9291 StudyThress et al., ASCO 2014组织样本 血浆样本 T790M +T790M-T790M +T790M-Response Rate55%22%58%24%(CR & PR)(23/42)(5/23)(22/38)(8/34)Disease Control Rate95%70%89%76%(CR, PR & SD)(40/42)(16/23)(34/38)(26/34)ARMS方法实时监测血浆EGFR

8、突变状态 23名EGFR敏感型突变的腺癌患者接受EGFR TKI治疗，监测血浆DNA EGFR突变状态（ II期和III期2人，IV期21人） 基线期（EGFR TKI治疗前）均未检测到T790M动态监测发现早于临床耐药进展的344天，血液中可检测到T790M突变（平均15-344天 ，图D） AB19外显子缺失T790M19外显子缺失T790Mcobas EGFR血液系统前3个月每4周取血样 3个月后每6周取血样 L858R T790MDCSorensen BS, et al. Cancer. 2014 Dec 15;120(24):3896-901.ddPCR方法检测 血浆游离DNA中EG

9、FR突变86位未经TKI治疗的NSCLC患者肿瘤组织与血液检测结果对比：ddPCR83.3%94%89.5%ARMS66.7%100%86%敏感性: 特异性: 一致率:敏感性: 特异性: 一致率:数字PCR特异性较好，灵敏度高于ARMSUnpublished data (collaboration with Hospital of Academy of Military Medical Science)肿瘤组织 血浆(ARMS)总计 (ARMS)+- +24024-125062Total365086血浆 (ddPCR)肿瘤组织 (ARMS)总计 +- +30333-64753Total3650

10、86二代测序(NGS)检测与分期有关,敏感性和特异性高 Newman et al., Nat Med (2014)分期敏感性特异性 I期 (n=4)50%96%II-IV期 (n=9)100%96%所有分期 (n=13)85%96%(For mutant allele fractions 0.02%)二代测序(NGS)检测Goldber SB, et al. 2014 ASCO Abstract 8093.患者特征 患者数（n=22） 肿瘤特征 患者数（n=22） 年龄（岁） 64（46-79） 肺腺癌 22（100%） 性别 男女 16（73%） 6（27%） EGFR基因敏感突变19DEL21L858R13（59%） 9（41%） 吸烟状态 从不吸烟既往吸烟 12（55%） 10（45%） 获得性耐药T790M突变阳性 11（50%） 11（50%） NGS检测研究终点ctDNA中EGFR敏感突变、T790M突变检测标本：(n=52)52例EGFR敏感突变肺腺癌患者血浆标本其中32例患者在治疗中多次取血样其中31例患者在获得性耐药时活检取样血液检测进展 从定性到定量检测 从静态至动态检测 从单基因到多基因、甚至基因组/外显子组检测液体活检