试验步骤--土壤氮的测定

1、试验步骤目录1、土壤pH 值的测定12、土壤温湿度的测定13、土壤有机质的测定24、全氮的测定25、无机氮（铵态氮、硝态氮）的测定26、可溶性有机氮37、微生物生物量氮的测定38、土壤酶活性的测定4【1】土壤脲酶测定4【2】蛋白酶活性的测定6【3】硝酸还原酶7【4】亚硝酸还原酶8【5】羟胺还原酶91、土壤pH值的测定用电位法测定土壤 pH值，水与土之比为 2.5：1。测定步骤如下：1.待测液的制备：称取通过2mm筛孔的风干土样10g于50m1高型烧杯中，加入25ml无二氧化碳的水或 1.0mol/L氯化钾溶液（酸性土壤测定用）或 0.01mol/L氯化钙溶液（中性、石灰性或碱性土测定用）。枯枝

2、落叶层或泥炭层样品称5g，加水或盐溶液50ml。用玻璃棒剧烈搅动1-2min，静止30min，此时应避免空气中氨或挥发性酸的影响。2.仪器校正：（以雷磁25型酸度计为例）接通电源，按仪器要求预热。量程开关层指向7-10或7-14档。装上已在蒸馏水中浸泡24h的指示电极玻璃电极及参比电极甘汞电极。校正。a将选择开关置于“pH”档位置。b将两电极插入装有标准缓冲液（如待测液为近中性，用pH6.86标准缓冲液；待测液为碱性，用 pH9.18标准缓冲液；待测液为酸性，用 pH4.01标准缓冲液）烧杯中。c温度补偿器尖头旋钮应指于待测液的温度位置。d将量程开关置于“7-0”档，或“7-14”档。e调零点

3、调节器，使指针在pH 7位置。f按下读数开关，调节定位调节器，使指针指在标准缓冲液pH值位置。g放开读数开关，指针应在7处，如有变动，则调节零点调节器至7处，用蒸馏水冲洗电极。3.测定用滤纸将附于电极上的剩余溶液吸干。将甘汞电极插在上部清液中，玻璃电极插入土壤悬液中，检查零位。按下读数开关，指针所指即为溶液的pH值。如指针在0-7的左端，可改选7-14的位置。一个待测液至少要重复测两次，取其平均值。测定完毕后，放开读数开关。冲洗电极，将所有按钮复原，拔去电源，取下电极，将玻璃电极浸入蒸馏水中，甘汞电极盖好塞子和套子后可装人盒内。2、土壤温湿度的测定对4种林型5cm、10cm、20cm、30cm

4、深处的土壤温度T5、T10、T20、T30以及土壤湿度W1、W2、W3、W4，设置1h测定一次。3、土壤有机质的测定称0.25g风干土，包在锡纸中，用TOC测定。4、全氮的测定采用AA3连续流动分析仪测定土壤全氮的含量。测定步骤如下：1、消煮：称取通过60号筛的风干土土壤样品0.5g左右(精确到0.000 1 g)，加入5 ml 浓硫酸和1.85 g混合催化剂。如果用100 ml 刻度消煮管消解土壤样品，定容后可取上清液直接上机测定。（混合催化剂：硫酸钾-硫酸铜-硒按照100:10:1的质量比配置，均匀混合后研磨，通过80号筛，贮于瓶中）。注：60号筛的筛孔直径是0.25mm；全自动消解仪一般

5、是150度消化60分钟，250度60分钟，400度120分钟。2、上机3、结果计算式中：土壤全氮的质量分数，%； 上机测试结果，mgL-1； V定容体积，mL； 10-3将mL换算成L的系数；10-3将mg换算成g的系数； 100换算成百分含量； 土壤质量，g。5、无机氮（铵态氮、硝态氮）的测定1、称10g（精确到0.01g）过2 mm筛孔新鲜土样于250 mL广口瓶内，加入1 mol/L氯化钾100 ml（74.5g氯化钾加去离子水定容到1L），塞紧瓶塞，至于振荡器上室温震荡1小时（200-250r/min）。定性滤纸过滤，滤液于24小时内分析，否则将滤液贮存于冰箱备用。2、上机3、结果计算

6、式中：土壤中某无机氮的质量分数，mgkg-1； 上机测试结果，mgL-1； 100氯化钾体积，mL； 10-3将mL换算成L的系数； 1000换算成每kg土含量； 土壤质量，g。6、可溶性有机氮TOC测浸提未熏蒸的土壤得可溶性总氮、铵态氮、硝态氮。可溶性有机氮=可溶性总氮-可溶性无机氮（铵态氮+硝态氮）7、微生物生物量氮的测定使用氯仿熏蒸浸提-淹水培养法测定。测定步骤如下：一、 试剂配制1 去乙醇氯仿的配制：在通风櫉中，量取100 ml氯仿至500ml的分液漏斗中，加入200ml的去离子水（氯仿:去离子水=1:2），加塞，上下振荡10下，打开塞子放气，而后加塞再振荡10下，反复3次，将分液漏斗

7、置于铁架台上，静止溶液分层，打开分液漏斗下端的阀，将下层溶液（即氯仿）放入200 ml的烧杯中，将剩余的溶液倒入水槽，用自来水冲洗。再将烧杯中的氯仿倒入分液漏斗中，反复3次。将纯化后的氯仿倒入棕色瓶中，加入无水CaCl2 10g，置于低温（4）、暗处保存。注：氯仿具有致癌作用，必须在通风櫉中进行操作。普通氯仿试剂一般含有少量乙醇作为稳定剂，使用前需除去。纯化后的氯仿加入无水CaCl2 ，以除去氯仿中的水分。2 0.5 mol/L K2SO4溶液：称取K2SO4 87.13g溶解于去离子水中，搅拌溶解（可加热），定容至1 L。二、操作步骤1. 熏蒸试验：称取20.00 g的过2 mm筛的新鲜土样

8、（如土壤湿度过大，只能借助镊子挑初土壤样品的动、植物残体等杂物，排除其对结果的影响），放入100 ml 的烧杯中，置于真空干燥器中，并放置盛有60 ml左右的去乙醇氯仿烧杯3-5个，烧杯内放入少量的沸石，真空干燥器底部加入少量水和稀碱(1 mol/L NaOH)。盖好盖子，用少量凡士林密封干燥器，用真空泵抽成真空，真空度控制在-0.07Mpa以下，使氯仿沸腾，并持续2-5 min，先关闭真空干燥器的阀门，再关闭真空泵。将真空干燥器放入25 的培养箱中，保持24 h 。熏蒸结束打开干燥器阀门时应听到空气进入的声音，否则为熏蒸不彻底，应重做。培养结束后，取出氯仿（氯仿倒回贮存瓶，可再次使用），反复

9、抽真空（-0.07Mpa；5-6次，每次3min），直到土壤无氯仿味为止。每次抽真空后，最好完全打开干燥器，以加速去除氯仿的速度。2. 空白试验：熏蒸的同时，另称取等量的土壤，不熏蒸，作为对照土壤，直接浸提。3. 0.5 mol/L K2SO4溶液浸提：处理后的土壤加入0.5 mol/L K2SO4溶液40 ml（水:土=2:1,有文献说明此比例提取的微生物碳浓度大，测定结果的变异系数小（林启美,吴玉光,刘焕龙.熏蒸法测定土壤微生物量碳的改进. 生态学杂志 1999,18(2):63-66.）) ，振荡30 min (25，200 r/min)后迅速用中速定量滤纸过滤，滤液立即测定或放入-18

10、下保存。注意：提前液保存时间过长（20h）会导致测定结果下降。低温（-18）下保存的土壤提取液，解冻后会出现一些白色沉淀（CaSO4或K2SO4结晶），对测定结果没有影响，不必除去，但取样前应充分摇匀。8、土壤酶活性的测定测定与土壤氮素相关的酶活性：【1】土壤脲酶测定苯酚-次氯酸钠比色法测定土壤脲酶活性 1 分析、方法及原理（1）分析意义 脲酶广泛存在于土壤中，是研究得比较深入的一种酶。脲酶酶促产物氨是植物氮源之一。尿素氮肥水解与脲酶密切相关。有机肥料中也有游离脲酶存在。同时，脲酶与土壤其他因子(有机质含量、微生物数量)有关。研究土壤脲酶转化尿素的作用及其调控技术，对提高尿素氨肥利用率有重要意

11、义。 （2）方法选择及原理脲酶是一种专性较强的酶，它能酶促尿素水解生成氨、二氧化碳和水。Rotini(1935)首先提出研究测定土壤脲酶。测定脲酶的方法有很大发展，常用的方法是比色法。 比色法:本法以尿素为基质，根据脲酶酶促产物一氨在碱性介质中，与奈氏试剂作用生成黄色的碘化双汞铵。该生成物数量与氨量相关。与苯酚一一次氯酸钠作用(在碱性溶液中及在亚硝基铁氰化钠催化剂存在下)生成蓝色的靛酚。该生成物数量与氨浓度成正比。反应式如下:NH3 + NaOCl NH2Cl + NaOHNH2Cl + C6H5OH + NaOH NH2C6H4OH + NaCl + H2ONH2C6H4OH + NaOCl

12、 NHC6H4O + NaCl + H2ONHC6H4O + NaOCl OC8H4NCl + NaOHOC8H4NCl + C6H5OH + 2NaOH OC6H4NC6H4ONa （靛酚）+ NaCl+H2O此法的结果精确性较高，重现性较好。【1 方法原理 脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物内。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨、二氧化碳和水。土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤，所以人们常用土壤脲酶活性表征土壤氮素的状况。土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质经酶促反应后测

13、定生成的氨量，也可以通过测定为水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨在强碱性介质与苯酚次氯酸钠的作用生成蓝色的靛酚，其颜色深浅与溶液中的NH4+-N含量成正比，进而分析脲酶活性。】2 试剂和材料（1） 甲苯分析纯。（2） 10%尿素:称取10g尿素，用水溶至100ml。（3） 柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)：取184g柠檬酸溶于300ml蒸馏水中，另取147.5g氢氧化钾溶于适量蒸馏水中，再将二种溶液合并，加蒸馏水至950ml左右,用1 mol/L NaOH将pH调至6.7,最后用蒸馏水定容到1000ml。（4） 苯酚钠溶液(1.35 mo/L)：称62.5g苯酚溶于少量无水乙醇

14、中，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，然后用无水乙醇稀释至100ml (A溶液)，保存于冰箱中。称27g NaOH溶于100 ml水中(B溶液)，保存在冰箱中。使用前，取A、B两种溶液各20 ml混合，用蒸馏水稀释至100 ml备用.（5） 次氯酸钠溶液:用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 (根据分析纯原有活性氯含量而定)（6） 氮的标准溶液:精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml,得到1 ml含有0.1 mg氮的标准液。3 分析步骤标准曲线的测定：将标准溶液稀释10倍(吸取10 ml标准液定容至100 mI)制成氮的工作液(0.01mg/ml)。从其中分别吸收0

15、、1、3、5、7、9、11、13ml移至50 ml容量瓶，然后加蒸馏水至20 ml,再加入4 ml苯酚钠溶液，充分混合。紧接着加入3 ml次氯酸钠，随加随摇匀，放置20 min后显色，用蒸馏水稀释至刻度。1 h内将显色液在可见分光光度计上于波长578nm处比色，以1cm比色皿进行比色测定，以试剂空白为参比。然后以氮工作浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。测定步骤：称取5g风干土，置于50 ml三角瓶中，加1 ml甲苯，轻轻摇匀，15 min后加10 ml 10%尿素溶液和20 ml柠檬酸盐缓冲液（pH6.7），并摇匀。然后放入37恒温箱中，培养24 h。培养结束后过滤，取3ml滤液加入

16、50 ml容量瓶中，然后加蒸馏水至20 ml,再加入4 ml苯酚钠溶液，充分混合。紧接着加入3 ml次氯酸钠，随加随摇匀，放置20 min后显色，用蒸馏水稀释至刻度。溶液呈靛酚的蓝色（在1 h内保持稳定）。1 h内将显色液在分光光度计上于578 nm波长处进行比色。4 结果计算以24小时后1g土壤中NH3-N的质量（mg）表示土壤脲酶活性（Ure）Urea2式中：a为由标准曲线求得的NH3N质量（mg）； 2为换算成1g土的系数。【2】蛋白酶活性的测定1.分析意义蛋白酶参与土壤中存在的氨基酸、 蛋白质以及其他含蛋白质氮的有机化合物的转化。它们的水解产物是高等植物的氮源之一。土壤蛋白酶在剖面中的

17、分布与蔗糖酶相似，酶活性随剖面深度而减弱。并与土壤有机质含量、氮素及其他土壤性质有关。2.方法选择与原理 蛋白酶能酶促蛋白物质水解成肽，肽进一步水解成氨基酸。测定土壤蛋白酶常用的方法是比色法，根据蛋白酶酶促蛋白质产物一氨基酸与某些物质(如铜盐蓝色络合物或茚三酮等)生成带颜色络合物。依溶液颜色深浅程度与氨基酸含量的关系，求出氨基酸量，以表示蛋白酶活性。比色法要求获得透明的滤液，故悬液离心( 6000转/min)效果较好，否则影响测定结果。3 试剂配制(1) 1%酪素溶液：用pH7.4的0.2M磷酸盐缓冲液配制。(2) 0.1N硫酸。(3) 20%硫酸钠。(4) 2% 茚三酮液：2g 茚三酮溶于1

18、00ml丙酮。(5) 甲苯。(6) 甘氨酸标准榕液: 取0.1g甘氨酸溶于水中，定容1L，则得1ml含0.02mg氨基氮的标准溶液。再稀释10倍制成工作液。标准曲线的绘制:分别吸取工作液1、3、5、7、9、11 ml移于50ml容量瓶中，加1ml茚三酮(注)，冲洗瓶颈后在沸水浴上加热10 min,将获得的着色溶液用蒸馏水稀释至刻度。在分光光度计上于500nm波长处比色测定颜色深度。以光密度为纵坐标，以氨基氮浓度为横坐标，绘制曲线。4 操作步骤 称4g风干土，置于50ml三角瓶中，加20ml 1%酪素液和1ml甲苯，小心振荡后用木塞盖紧，在30恒温箱中培养24h。培养结束后，于混合物中加2ml

19、0.1N硫酸和12ml 20%硫酸钠液，以沉淀蛋白质，然后离心15min(6000转/min)。取上清液2ml,置于50ml容量瓶中，加1ml茚三酮(注)，冲洗瓶颈后在沸水浴上加热10 min,将获得的着色溶液用蒸馏水稀释至刻度。在分光光度计上于500nm波长处比色测定颜色深度。每个土样均要做无基质对照，以除掉土壤原来含有的氨基氮而引起的误差。整个试验要做无土壤对照。5 结果计算 蛋白酶活性，以24h后1g土壤中氨基氮的质量（mg）表示。Ure =a5式中：a为从标准曲线求得氨基氮质量（mg）； 5为换算成1g土的系数。（注）：茚三酮比色法测蛋白酶，也可以由无水乙醇作沉淀剂。方法如下：培养结束

20、后，过滤培养物，取5m1滤液，加20ml无水乙醇，以沉淀未经水解的基质。摇动后，静止5min后再过滤。吸1-2m1滤液，置于50ml容量瓶中，加1m1 2%茚三酮液，加热着色，稀释至刻度，然后比色测定。【3】硝酸还原酶1 分析意义 硝酸盐还原酶和亚硝酸还原酶能酶促土壤硝态氮还原成氨。测定这些酶可了解土壤氮素转化中脱氨作用强度。硝酸还原酶还参与土壤中铁的还原作用。2 方法原理土壤中硝酸盐在硝酸盐还原酶、亚硝酸还原酶和羟胺还原酶作用下转化成氨。反应式如下: NO3- NO2- NH2OH NH4+在存在氢的供体时及厌气条件下，测定反应前后硝酸态氮与酚二磺酸作用的蓝色反应差数，用于表示硝酸还原酶活性

21、(蓝色物质颜色深度与硝酸态氮量相关)。3 试剂配制(1) 1% KNO3溶液。(2) 1%葡萄糖。(3) CaCO3。(4) 铝钾矾饱和溶液。(5) 酚二磺酸:取3g重蒸酚与37g (20.1 ml)浓H2SO4混合，在沸水浴上回流加热6h即成。(6) 10% NaOH。(7) KNO3标准溶液:精确称取16.3052g重结晶KNO3溶于蒸馏水中并稀释至1L (1ml含10mg NO3-N)。使用前，将标准液再进行稀释(1ml含0.1mg NO3-N)。标准曲线绘制:吸取50ml KNO3标准溶液，置于瓷皿中，在沸水浴上蒸干，残渣用2ml酚二磺酸处理10min。再加15ml蒸馏水，定容500m

22、l(1ml含0.01mg NO3-N)。吸取此溶液5-40ml于50ml容量瓶中，用10% NaOH调至微黄色，定容后在分光光度计上于400500nm处进行比色。以光密度值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。4 操作步骤取1g土壤置于100ml减压三角瓶中，加20mg CaCO3和1ml 1% KNO3。仔细混合后，加1ml葡萄糖(作为氢的供体)。将此混合液抽气3min,稍摇荡三角瓶，置于30恒温箱中培养24h。培养结束后，加50ml水、1ml铝钾矾液。取20ml液移于瓷皿上蒸干。加1ml酚二磺酸处理10min,加15ml水，再加10% NaOH调至碱性。将着色液转至50ml容量瓶中，定容、

23、比色(波长为400500nm)。用灭菌土壤(180加热3h)作对照。 5 结果计算硝酸还原酶的活性，以24h后，10g土壤中被还原的NO3N的质量（mg）表示。【4】亚硝酸还原酶 1 方法原理 通过亚硝酸盐与Tpucc试剂反应，测定酶促反应前后NO3-N的变化量，用以表示亚硝酸还原酶活性。 2 试剂配制(1) 0.5% NaNO2溶液。(2) 1%葡萄糖。(3) CaCO3。 (4) 铝钾矾饱和溶液。(5) Tpucc试剂:用比重为1.04的醋酸分别配制0.1% -萘胺溶液(a)和0.5%对-氨基苯磺酸溶液(b)，用前将等体积(a)、(b)液混合即成。(6) 亚硝酸钠标准溶液:准确称取0.15

24、00g NaNO2溶于1ml蒸馏水中。使用前稀释100倍配制成工作液(1ml 含0.001mg NO2)。标准曲线绘制：取工作液110ml移于50ml容量瓶中，加4ml Tpucc试剂。15min后定容比色测定(波长为550600nm)。以光密度值为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。3 操作步骤称1g土壤置于100ml减压瓶中。加20mg CaCO3，仔细混合。加入1ml 0.5% NaNO2溶液和1ml 1%葡萄糖溶液(作为氢的供体)。将此混合液抽气3min,稍摇荡三角瓶，置于30恒温箱中培养24h。用灭菌(180,3h)土壤加2 ml水作为对照，同时作试剂空白对照(不加土壤，其余同样品处理

25、)。实验设3次重复。培养结束后，往瓶中加入50ml蒸馏水和2ml铝钾矾饱和试剂，并将悬液用致密滤纸过滤，吸取1ml滤液移于50ml容量瓶中，加5ml蒸馏水和4ml Tpucc试剂，显色后定容，比色。4 结果计算亚硝酸还原酶活性，以24h后，10g土壤中被还原的NO2-N的质量（mg）表示。【5】羟胺还原酶1 方法原理羟胺还原酶可将土壤氮代谢过程中形成的中间产物羟胺还原成氨。通过羟胺与醋酸酐、氯化铁的生色反应，计算羟胺与土壤作用后剩余的未被还原的量，用于表示羟胺还原酶活性。2 试剂配制(1) 0.5% NH2OHHCl水溶液（盐酸羟胺）。(2) CaCO3。(3) 1%葡萄糖。(4) 铝钾矾饱和

26、溶液。(5) 醋酸酐。(6) 1M（1mol/L） FeCl3。(7) 羟胺的标准溶液:准确称取2.1046g NH2OHHC1溶于1L水中(1ml 含1mg羟胺)。再将此溶液稀释10倍(1ml含0.1mg羟胺)。 标准曲线绘制:取不同浓度的标准溶液 10ml移于50ml容量瓶中，加0.5ml醋酸酐和0.4ml 1M FeCl3溶液，仔细摇匀后定容。在分光光度计上于600nm处比色测定。以光密度值为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。 3 操作步骤取1g土壤置于100ml减压瓶中。加20mg CaCO3,混合后加1ml 0.5% NH2OHHCI溶液和1ml 1%葡萄糖溶液(作为氢的供体)。将此混合液在10-12 mmHg的压力下抽气3min（抽出瓶中空气），将瓶仔细摇荡后置于30恒温箱中培养24h。用灭菌(180,3h)土壤加2 ml水作为对照，同时作试剂空白对照(不加土壤，其余同样品