2 基因工程的基本技术 6

1、LOGO基因工程的基本技术主要有：LOGODNA/RNA提取技术电泳技术PCR技术分子杂交DNA序列分析基因突变技术等DNA和RNA的提取和纯化LOGO一、DNA提取的基本原理和方法(一)DNA提取的基本原理1.DNA的性质DNA是极性化合物，溶于水，不溶于有机溶剂， DNA水溶液呈黏性胶体状。在酸性溶液中易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。LOGO2.DNA提取的基本步骤(1)细胞裂解和DNA的溶解主要任务：破碎细胞并对DNA快速实施保护：利用液氮在超低温下研磨，使酶失活；快速加入缓冲液并迅速混匀；LOGO(2)与核酸结合的蛋白质及RNA等杂质的去除。去除蛋白质十六烷基三甲基溴化铵(CTAB

2、)十二烷基硫酸钠(SDS)或二甲苯酸钠苯酚氯仿去除RNA可加入不含DNA酶的RNA酶LOGO(二)DNA提取的几种方法1. 浓盐法2. SDS法3. CTAB法4. 苯酚抽提法5. 水抽提法LOGO(三)质粒的提取其中质粒DNA的提取最常用的是碱抽提法。有时候也用煮沸法。LOGO（一）碱抽提法提取质粒DNA变性强碱DNA双链DNA单链中性复性闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；LOGO1、原理染色体线性DNA和有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。变性LOGO（二）煮沸法提取质粒原理：细胞壁、膜一经破损后，

3、立即在100度煮沸40s，使L-DNA和cccDNA变性，然后迅速恢复中性，前者不复性，后者复性，离心去掉L-DNA、RNA、蛋白质等大分子复合物，提纯ccc。LOGO二、RNA提取的基本原理与方法LOGO自学三、DNA或RNA浓度、纯度和相对分子质量的测定（一）紫外光光度法测定DNA、RNA的浓度和纯度原理：DNA（或 RNA）在260nm波长处有特异的紫外吸收峰。用微量比色杯（10ml）在紫外分光光度计直接测定。LOGO1、浓度测定OD260不仅与总含量有关，也受构型影响。1ugmL DNA的OD260=0.021ugmL DNA/RNA或ssDNA的OD260=0.022-0.024LO

4、GO即50ugmL dsDNA37ugmL ssDNA 40ugmL RNA 30ugmL 寡核苷酸1 OD260=可据公式来计算ssDNA、dsDNA、RNA的浓度： SSDNA=33(OD260-OD310)稀释倍数dSDNA=50 (OD260-OD310)稀释倍数SSRNA=40 (OD260-OD310)稀释倍数LOGO纯DNA：A260A280约1.8，大于1.9表明有RNA污染， 小于1.6表明有蛋白质、苯酚等的污染；纯RNA:A260A280在1.7和2.0之间，小于1.7表明有蛋白质和苯酚污染，大于2.0表明有异硫酸胍残存。LOGOLOGO（二） 琼脂糖凝胶电泳估计原理：溴化

5、乙锭（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能发 红色（澄红）色荧光。与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA含量。LOGO一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNA标准混合液对比得知。DNA分子量Marker有许多公司的商品，使用非常方便。如lDNA的Hind酶切物等。MarkerMarkerLOGODNA MarkerDNAladder1000bp28kb 20kb 5000bp900bp 800bp 700bp600bp 500b400bp 300bp 200bp100bp2500bp 2300bp900bp 750bp 200bpLOGOp1.溶菌酶能水解菌体细胞壁的

6、主要化学成分肽聚糖中的b-1，4糖苷键。在碱性条件（pH8）下有活性。2.葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。LOGO四、相关试剂及作用3.EDTAMg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性， 防止DNA被酶降解，并有助于容菌酶发挥作用。4.SDS十二烷基磺酸钠，膜的强的去垢剂，蛋白质变性剂， 小分子， 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。注意：膜的温和去垢剂有：riton-100,作用原理同SDS。LOGO5.乙醇、异丙醇用于沉淀DNA。0.6倍体积的异丙醇。LOGODNA分子以水合状态“溶

7、于”水里， 乙醇能夺去DNA分子的水环境。6. RNase A降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。7.TE缓冲液DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。LOGOTris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲业），有利于以后操作； EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。8. 酚-氯仿选用蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在DNA溶液中。（现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。注意：还可以用酚或氯仿异戊来使蛋白质变性LOGO以上试剂有商业试剂盒； 也可以自己配制。9. 蛋白酶K细胞裂解10.CTAB(十六烷基三甲基溴化铵

8、)：除去多糖11.液氮动植物组织粉碎LOGOq 问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。原因对策LOGO1. 重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）2. 重新沉淀DNA，让酒精充分挥发3. 增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）1. DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质2. DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应3. DNA中残留有金属离子五、DNA提取常见问题q 问题二：DNA降解。原因对策1. 材料不新鲜或反复冻融2. 未很好抑制内源核酸酶的活性3. 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断4. 外源核酸酶污染5. 反复冻融1. 尽量取新鲜材料，低温保存材料

9、避免反复冻融2. 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液3. 在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量4. 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5. 所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌6. 将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融LOGOq 问题三：DNA提取量少。原因对策1. 实验材料不佳或量少2. 破壁或裂解不充分3. 沉淀不完全4. 洗涤时DNA丢失1. 尽量选用新鲜（ ）的材料2. 动植物要匀浆研磨充分；G 菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁3. 高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）4. 低温沉淀，延长沉淀时间5. 加辅助物

10、，促进沉淀6. 洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒LOGO电泳技术2LOGO一、电泳的基本原理带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率。大小、形状以及介质的粘度LOGODNA、RNA的磷酸-糖骨架的磷酸基团是电 离化的,因此是多聚阴离子链，由于磷酸-糖骨架的重复特性，单位质量的单双链以及长的短的DNA所带电荷相等。V QE / f如果电场强度一定（电压和电极距离）、电泳介质相同（电泳液和凝胶）：分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状。形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关: 分子量越大，移动越慢。LOGOIncreasing deg

11、ree of supercoilingRelaxedsupercoiled相同分子量的DNA:闭合环状卷曲超螺旋迁移最快， 线性分子次之，伸展开环状最慢。LOGOLOGOLOGO二 、琼脂糖凝胶电泳(一)琼脂糖凝胶1. 琼脂糖2. 琼脂糖凝胶琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体“胨”。琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）。浓度高空隙小LOGO是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。3. 低熔点胶（1）低熔点（LMP）的琼脂糖凝胶：昂贵，熔点为6265的琼脂糖衍生物，一旦溶解，便可以在37下保持液体状态达数小 时之久，而在25也可以保持液体状态约10

12、min。LMP琼脂糖可以不经电洗脱或破坏凝胶剂 就可用来回收或进一步处理DNA。（2）常熔点的琼脂糖凝胶：便宜LOGO空隙大小决定其分辨分子大小的能力。LOGO琼脂糖浓度0.30.60.70.91.21.52.0L-DNA5-60 1-200.8-100.5-70.4-60.2-40.1-3大小/kb空隙小，分辨率高：小分子较易通过，而大分子难通过； 空隙大，分辨率低：大小分子几乎以同等速率通过。4.琼脂糖凝胶的分辨力v 基本过程：制胶放入电泳槽中并加入电泳缓冲液取出梳子点样电泳取出凝胶进行EB染色扫胶，分析结果注意：溴化乙锭具有致癌性，操作时要带手套。LOGO5.琼脂糖凝胶电泳的基本过程(二

13、)DNA电泳影响因素1. DNA分子大小2. DNA分子构型超螺旋最快、线状分子次之，开环分子最慢。3. 凝胶浓度4. 电场强度电场强度高(5V/cm)，电泳速度快，但分辨率低。在精确测定时降低电压至1V/cm，分辨率高LOGO5.溴化乙锭(EB)EB具有扁平结构，能嵌入到DNA碱基对间。 EB对线状与开环分子影响较小，对超螺旋态分子影响较大。当嵌入的EB分子增多时，负超螺旋状态向共价闭 合环状转变，迁移速度由快变慢；当嵌入的EB分子进一步增加时，DNA分子向正超螺旋状态转变，这时电泳迁移速率又由慢变快。6.电泳缓冲液LOGO三、琼脂糖变性胶电泳RNA为单链，链内容易配对形成二级结构。不同RN

14、A结构不同，在未变性条件下，其相对分子质量与电泳移动距离没有严格的相关性。须在变性条件下破坏RNA空间结构后电泳，使RNA移动距离与其相对分子质量对数成正比。LOGO三、琼脂糖变性胶电泳常用的RNA变性胶：一种为含有乙二醛一二甲基 亚砜(DMSO)的凝胶，另一种是含有甲醛的凝胶。前者比后者更难电泳，因为电泳缓慢且需要电泳 液循环，以避免形成高H+梯度。二者分辨率相近， 但后者的杂交带更锐利，甲醛变性胶电泳操作更方便。LOGO1. 指示剂核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青.溴酚兰在碱 性液体中呈紫兰色;二甲苯青的水溶液呈兰色.溴酚兰二甲苯青LOGO凝胶浓度1%1.4%迁移率kb21.6凝胶浓

15、度0.6%1%1.4%2%迁移率kb10.60.20.15四、核酸电泳的指示剂和染色剂指示剂的作用指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液. 载样缓冲液的作用有:增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入 加样孔内.在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可预测核酸电泳的速度和位置.使样品呈色，使加样操作更方便.LOGO一般加入量为样品量的五分之一。2. 染色剂最常用的是EB染色法，其次是银染色. (1)、溴化乙锭EB分子可嵌入dsDNA碱基对之间，在UV（300 nm波长）激发下，发出红色荧光。在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后用EB溶液浸 泡凝胶10

16、15min；肉眼可见DNA带，DNA量一般5ng；当EB太多，DNA带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察。LOGOEthidium bromide（EB）LOGOLOGOLOGOUVP全自动凝胶成像分析系统LOGOOMEGA8-LOGO全自动凝胶成像分析系统LOGO（2）银染色:银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物， 然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色， 也用于琼脂糖凝胶染色，其灵敏度比EB高200倍。但银染色后，DNA不宜回收.LOGO聚合酶链式反应技术2LOGOLOGO PCR 仪LOGO一、 P

17、CR技术的概述聚合酶链式反应(PCR)是Kary Mullis于1985年发明的核酸体外扩增技术，是基因工程研究不可或缺的基本技术。LOGOLOGO（一）原理PCR的基本原理v PCR反应条件9550v PCR过程vPCR的特点引物1引物2LOGODNA引物PCR的基本原理v PCR反应条件5702v PCR过程vPCR的特点Taq酶引物1引物2Taq酶LOGODNA引物PCR的基本原理vPCR反应条件7925vvPCR过程PCR的特点第1轮结束第2轮开始LOGOPCR的基本原理v PCR反应条件95720Taqv PCR过程v PCR的特点TaqTaqTaqLOGOPCR的基本原理vPCR反

18、应条件72vPCR过程vPCR的特点第2轮结束LOGO模板DNAPCR的基本原理第1轮扩增v 第PC2R轮反应扩条增件v PCR过程v PCR的特点第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增LOGO中温延伸72oC 1-2minLOGO440-6572 10min低温退火3772 1min95oC 5min高温变性94oC 30sPCR三个阶段注意：1. 变性：如模板的G+C含量较高，变性时间可适当延长。2. 退火：温度取决于引物的Tm值，一般引物越短，退火温度越低，反之则高。退火温度越高，特异性越强，扩增效率随之降低。LOGO25-35cyclesTarget(起始模)3 X 1051.5 X

19、 104所需循环数25-30(1vg哺乳动物DNA)30-3535-4040-451X 10350扩增效率：Nf=N0(1+Y)nLOGO3、循环次数PCR 后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。(一般已经积累0.3-1 pmol产物)原因随着引物、dNTP浓度降低，掺入速度减慢；随产物增加，酶与模板的比例下降；DNA 聚合酶的稳定性或活性降低 ;产物的再结合，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物 变性不彻底。非特异性产物或引物二聚体与反应物的竞争；LOGO4、平台效应 plateaueffectPCR使用专门合成的DNA引物。延伸过程是在高温下进行。这就避免了一般DNA聚合酶污染和非

20、引物延伸形成的DNA。需要的模板量极低。理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109条！LOGO（二）敏感性高（一）特异性强三、PCR的特点整个PCR过程约2.5-4小时即可完成。对模板的纯度要求低。RT-PCR：先用逆转录酶将mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增。LOGO（五）可以扩增mRNA不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。（四） 简便（三）快速四、PCR的反应体系（一）缓冲液buffer(1X)LOGO50m MKCl引物退火annealing10m MTris-HClpH8.3-9.0（室温）延伸温度（72 ）下，pH 值接近

21、7.2 。1.5m MMgCl2激活DNA聚合酶的活性中心，特异性和(0.5-2.5)产率，-20度保效,Mg2+不含有沉淀析出0.01%明胶(0.1%Triton-100)有时还加入一些添加剂和共溶剂可降低错配率，提高富含 G+C模板的扩增效率。Taq DNA聚合酶要求有游离的Mg2+ 。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性（杂带） 。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。一般用1.5-4.5mmol/L的MgCl2终浓度。LOGOMg 2+ 的浓度（二）模板（template) 纯度：PC

22、R对模板DNA的纯度要求不高。 模板的量：一般104-107个模板分子可达到满意的效果，一般 宜用ng级的克隆DNA、ug水平的染色体DNA或10-10拷贝待扩增的DN段作为起始材料。LOGO不能太多，100ml反应体系中100ng足够。但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。（三）dNTPsdNTPs 是 dATP、dTTP、dCTP和dGTP的总称。贮备液为pH 7.0左右，其浓度一般为20mM，- 20保存，体系中为200M即可，过低则反应速度下降，浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活性并增加错配率,即特异性下降。LOGO4种dNTPs 应平衡,提高忠

23、实性使用时,应考虑Mg2+、引物和产量之间的关系如序列分析和制备探针时，用20-40uM（1）特点 热稳定性Taq DNA聚合酶的最大特点是热稳定性， 耐高温。 最适温度高75-80 oC约35-150nt/s酶分子最适温度：延伸速度：最长延伸长度：6.7kbLOGO1. Taq DNA聚合酶（四） DNA聚合酶 Taq酶的功能缺点具53方向的聚合活性、5 3方向的外切酶活性以及逆转录酶活性，但没有3 5外切酶活性，不能修复错误的碱基配对！而且聚合完成后在3端引入非模板互补核苷酸A，从而克隆时须用T-vector。合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。LOGO

24、TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)10080604020酶活性401005060708090温度()LOGO(%)2.Tth DNA聚合酶在Mg2+存在下可以以DNA为模板合成DNA，而在Mn2+存在下以RNA为模板合成cDNA。因此可在高温下催化RT-PCR、反转录和引物延伸反应。无3 5DNA外切酶活性。3.VENT DNA聚合酶有35外切酶活性，能够校正碱基的错配。能耐受100oC高温。LOGO有3 -5的外切酶活性，5-3外切酶活性。是Taq和Pfu DNA聚合酶的混合物。LOGOTaq的PCR产物3端往往带有一个A。5.Taq Plus DNA Polymeras

25、e但PCR产物为平端！是目前已发现的所有耐高温DNA 聚合酶中出错率最低的。4. Pfu DNA Polymerase（五）引物（primer)1.定义：引物是指在PCR反应中与待扩增的靶DNA区段两翼互补的寡聚核苷酸，其本质是单链DN段。PCR扩增产物的大小及扩增的靶序列在基因组中的位置是由引物限定的。LOGO（1）引物的长度(1)长度一般为1630bp为宜，最佳为2024bp更短的引物一般会降低扩增特异性，但会提高有效性，扩增的产物种类会增多。LOGO2.引物应该满足的条件(2)G+C含量一般为40-60为佳，两条引物G+C含量应尽量相似，Tm最好接近，差异最好在1以内，最多不超过5。LO

26、GO适当提高复性温度可以提高引物与模板结合 的特异性，减少非特异产物的出现。(3)两个引物之间不应发生互补，特别应避免形成“引物二聚体，如果无法避免，其3端互补不 应大于2个碱基。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶连续排列，避免同源序列(尤其6个碱基以上相同)。primer15GGTCTGCCAGTCTAC33CAGGACTTAGTCACT5primer2LOGO(4)引物内部避免形成次级机构，尤其发卡结构，若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp,必要时应通过计算机进行结构分析。5GGCAGTCTGCCAGTCTAC3T CTGCCAGTCTAC3发卡结构GACGG5LOGO(5)引物的延伸从

27、3端开始，3端不能进行任何修 饰，也不能有形成任何二级结构的可能，3末端 最后1个碱基最好是G或C。LOGO(6)引物的5端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可被修饰而不影响扩 增的特异性。5端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。LOGO3553限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记LOGO(7)引物3端不要终止于编码区域子的第3位，因子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。LOGO3.引物设计引物设计现在多用专业软件如Primer5.0等LOGO(六)PCR反应的最佳条件1.2.3.Taq D

28、NA聚合酶的浓度为2.5U/100uldNTP的浓度为20-200uM, Mg2+浓度为0.52.5mM；200uM4.引物的浓度为0.21.0uM，一般使用终浓度各0.5mM。5.10X扩增缓冲液：10ulLOGO（一）实时定量PCR（二）反向PCR（三）随机引物PCR（AP-PCR）（四）多重PCR（五） LP-PCR（Labelled primers)（六）反转录PCR（RT-PCR)锚定PCR RACE技术自学LOGO五、PCR技术的扩展（PCR的应用）（一）实时定量PCR1、概念在反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积 累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对模板中特定基因进行定

29、量分析的方法。LOGO2.荧光定量PCR特点光谱技术高精确性高灵敏性高特异性高精确性PCR高灵敏性DNA杂交高特异性LOGO3.荧光定量PCR常用技术Taqman 技术SYBR Green荧光染色法分子信标技术FRET(荧光共振能量转移)技术LOGO（1）Taqman 技术v PE公司开发v 原理：荧光探针:一个能与PCR产物杂交的荧光标记的基因探针，其 5 端标记报告基团（Reporter, R）， 3 端标记荧光抑制基团（Quencher, Q）,在一定距离范围内，Q 基团可吸收R 基团发出的荧光，因此，只有探针被切断后，R 基团的荧光信号才能被检测到当溶液中有PCR产物时，该探 针可与模

30、板的特异序列结合当Taq酶靠近探针时， 激活了Taq酶的外切酶活性，将探针5 的R切下，R基团发出荧光，根据荧光强度计算初始模板的数量LOGO 、Taqman 技术原理自动化荧光检测法 信号基因（Qeporter），单独存在时可以发光 抑制基因（Quencher），其存在时可抑制信号基因的功能，不产生发光现象LOGO特异性荧光双标记探针Taq酶53外切酶活性LOGOLOGO优点准确定量,定量范围宽; 特异性强; 操作快速,无须做梯度稀释,无须PCR后处理; 技术简单,安全.缺点实际上探针较长使两端基团距离较远,导致荧光淬灭难以彻底;定量时受酶性能影响设备昂贵，难以普及LOGO方法学评价（2）

31、SYBR Green荧光染色原理SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料.当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因 此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。LOGO 原理SYBRGreen I 荧光染料与DNA双 链 的结合LOGOSYBR Green DetectionLOGO 特点优点成本低缺点结合到反应体系的所有dsDNA上,所以特异性不如TaqMan探针。容易产生非特异信号,本底光较大LOGO（二）反向PCR ，reverse PCR扩增两个引物外侧的未知序列3553（传统PCR只扩增两个引物质之间的已知序列）。

32、把线性DNA模板转变成环形分子。LOGO2、技术关键templatetemplate1、特点是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DN段，对某个已知DN段两侧的未知序列进行扩增。已知序列未知序列未知序列LOGO3、原理限制酶限制酶未知序列已知序列未知序列LOGO连接酶使引物的外侧序列 “转变” 成内侧序列。LOGOLOGO可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DN段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。4、用途（三）随机引物PCR，AP-PCR）1、概述：又称随机扩增多态性 DNA（ Random amplified polimophic

33、 DNA ，缩写为 RAPD2、特点：（1） 引物长 8-10 碱基，短；（2） 引物的序列随机（3） RAPD 反应的条件与普通 PCR 基本相同。但由于引物较短，一般退火所需温度较低。（4） RAPD 不需知道模板 DNA 的序列，扩增出来的片段也是非特异性的；而普通 PCR则必须知道待扩增目的片段的序列，根据这一序列设计一对相应的引物LOGO3、特点用途：RAPD 技术一出现，便以它的简便、快捷和多态性捡出率高而引起科学工作者的极大兴趣。目前这一技术已被广泛用于遗传图谱构建、群体遗传结构分析、 DNA究领域分析和基因定位等不同研LOGO用于检测特定基因序列的存在或缺失。引物电泳LOGO（

34、四）多重PCR根据要检测的某一个DNA上的n个特定序列，分别设计n对引物，这些引物与膜板在统一个反映体系内，若要检测的特定序列存在，经过PCR后，并可以通过相应引物扩增出来， 若不存在，就扩不出来这样，PCR后经过凝胶电泳，便可以检测出哪些特定基因存在， 那些不存在用途：一次检测某个DNA 上的多个不同序列。LOGO利用同位素、荧光素等对引物的5端进行标记，用来检测靶基因是否存在特别适合大量临床标本的基因诊断可同时检测多种基因成分病毒1病毒2病毒3病毒4LOGO（五） LP-PCR标记PCR（Labelled primers)LOGO观察PCR产物标记引物 六、 PCR技术的应用在基因的某处引

35、入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。LOGO2、基因的体外诱变1、扩增某一段DNA技术关键：LOGO利用引物的5端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。3、基因组的比较研究比较不同物种之间的基因组特征和相似性。 RAPD (Random amplified polymorphism DNA)利用6bp长度的随机序列引物扩增细胞中的总DNA，将会得到许多非特异性产物，反映了该引物序列在基因组中的分布状况。类似于限制性内切酶片断长度多态性（RFLP）分析，因而也称为随机扩增多态性DNA（RAPD）分析。LOGO核酸和蛋白质的分子杂交3LOGO一、概述核酸分子杂交技术，是在1968

36、年由华盛顿卡内基学院的Roy Britten及其同事发明的。LOGO(一）分类Southern印迹杂交:鉴别DNA靶分子的杂交Northern 印迹杂交:鉴别RNA靶分子的杂交Western 印迹杂交: 鉴别蛋白质分子的杂交LOGO探针已与待测核酸片段中的同源序列形成杂交分子，探针分子显示的位置及其量的多少，反 映出待测核酸分子中是否存在相应的基因顺序及其含量与大小。核酸分子杂交实质上是双链核酸分子变性和具同源序列的两条单链复性的过程。杂种核酸分子：退火的核酸来自不同的生物有机体所形成的双链分子。LOGO（二）原理：碱基互补配对二、常用分子杂交类型（一）Southern blotting1.概

37、述1975年，英国Southern创建用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），再用探针杂交。只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。LOGOSouthern blot 筛选结果LOGO待测DNA样品的制备、酶切待测样品的电泳分离凝胶中DNA的变性（碱变性）转膜(印迹)(毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法)Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜) 杂交结果的检测LOGO2.Southern 杂交的流程（a）基因组DNA DNA限制片段（b）（c）（d）硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因（e）LOGOX光底片 DN段2.Souther

38、n杂交的流程LOGOLOGO(二) Northern blotting用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。LOGO主要检测插入片断是否被转录。v 是指DNA-RNA分子杂交，应用特异性基因探针分析基因的转录水平。提取Cell总RNA提纯分离mRNA琼脂糖凝胶变性电泳分离RNA转移至硝酸纤维素膜杂交检测LOGO2. 步骤1. 原理及特点NorthernBlotLOGO(三)茵落原位杂交噬菌斑杂交、原位杂交菌落或噬菌斑转移到NC上溶菌、变性滤膜交联或烤干与DNA或RNA探针杂交洗去未杂交的探针曝光分析结果挑选出含有插入序列的菌落或噬菌斑LOGOp48图4-

39、6LOGO (六)Western blotting1.定义：通过抗原抗体的免疫反应，从混合蛋白质样品中检测出特异目的蛋白。LOGO2.实验步骤先将蛋白质混合物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳展开，然后将凝胶中的蛋白质条带转移到固相膜(硝酸纤维素滤膜或PVDF膜)上。点样电泳方向LOGO聚偏乙烯膜 Western装置LOGO Blotting原理与ELISA相同。HRPO或碱性磷酸酶底物产物，并发出光辣根过氧化物酶：HRPO底片曝光LOGO硝酸纤维素膜待测蛋白一抗二抗PAGE胶待测蛋白LOGODNA序列分析4LOGO DNA测序方法概述Maxam-Gilbert法（化学降解法）Sanger法（末端终止法）DNA自动测序法LOGOSanger等1977年发明。Frederick Sanger, 1980年Nobel Prize化学奖LOGO一、双脱氧链终止法1. 原理v 采用核苷酸链终止剂ddNTP终止DNA的延长。由于它缺少形成3/5/磷酸二