园林植物快速繁殖技术知识要点

1、园艺植物离体培养学的基本含义1. 植物离体培养指通过无菌操作，使植物体的各类结构材料（外植体）接种于人工配制的培养基上，在人工控制的环境条件下，进行离体培养的一套技术与方法，通常称之为植物组织培养式植物的细胞与组织培养。2. 离体培养技术体系胚胎培养及以胚胎为基础的培养技术器官及器官原基培养组织培养细胞培养原生质培养及以原生质体为基础的培养技术3. 离体培养的应用多种的繁育与脱毒种质资源的贮存细胞次生代谢物质的生产细胞工程和基因工程的生物技术育种遗传学和生物学基础的研究 园艺植物离体培养学的形成与发展（一）、植物离体培养的渊源及其早期的实践 1902年、haber landt提出了细胞全能性的

2、观点，并首次进行植物细胞培养实验。（二）、植物离体培养基本技术体系的形成 1934年white首次建立了番茄的无性繁殖系 1937年white发现b族微生物素和吲保乙酸对离体培养的作用 19341939年white等人初步建立起植物离体培养的基本方法 1943年white发表了第一部植物离体培养专著植物组织培养手册又重新提出了细胞全能性。 1957年skaog建立了器官分化的激素配比模式。 1953年muir报道了细胞悬浮培养法。（三） 园林植物离体培养学科的建立 1、完善离体培养技术、探索理论基础 19641966年诱杀未成熟花粉形成单位体植株。 1960年分离番茄动根原生质体获得成功， 1

3、978年首先获得了体细胞杂种“potamato”. 植物细胞全能性为基因转化提供方便。2、开拓应用研究 生产上应用最广泛，最成功的领域是离体快速繁殖。 植物离体培养学与园艺科学的关系（一）、离体培养与园艺植物良种繁育学（二）、离体培养与园艺植物育种学（三）、离体培养与园艺植物基础学科 第一章 离体培养的基本操作方法 通过学习，理解和掌握离体培养的基本操作方法包括：一般的材料选取、无菌技术、培养基配置和环境条件调控为园林植物快繁技术打下基础。 外植体的选择与处理外植体植物离体培养中的各种接种材料，包括植物体各个器官、组织、细胞和原生质体等。 外植体的选择1. 选择优良的种质主要的园艺植物选取性优

4、良的种质先特殊的基因型要有明确目的 具有一定的代表性1. 选择建壮的植株生长建壮的无病虫害的植株正常的器官和组织多年生植物应从成年树上取材1. 选择外植体的大小对植体太大易污染 太小多形成愈伤组织外植体大小在0.51.0cm。1. 选取对植体的时期一般按照植物生长的最适时期取材含酚类物特多的植物，应在酚类物含量低的季节取材从种苗圃推算苗期，增殖代数等因数，确定选取外植体的合适时期。1. 选择细胞培养材料通常根据细胞培养的目的 选择细胞培养材料多数采用茎类分生组织和胚胎培养的愈伤组织作为细胞培养的起始材料。为了生产次生代谢产物，则选取某次生物质含量高的特定器官或组织。 （二）、培养材料的处理 1

5、、母株的预处理 促使母株的生长带谢活跃 方便取材 容易灭菌 降低污染率 2、外植体休眠期的处理 通常采用低温或者赤霉药剂进行处理 ， 3、外植体的灭菌 进行严格的灭菌 林料来源 取材部位 取材季节 第 二节 培养茎的制备 培养茎的种类及组成1. 培养茎外植体生长的营养物质，通常有两个水平，一是基本培养茎包括大量元素和微量元素，维生素和氨基酸，还有糖和水。二是完全培养茎，即在基本培养的基础上，根据各种不同实验要求，附加一些物质，如各种植物生长调节剂以及其它的复杂有机附加物，外植体生长的营养物质。 基本培养茎 大量元素+微量元素+维生素+氨基酸+糖+水完全培养茎基本培养茎+植物生长调节剂（有机附加

6、物）2. 固体培养茎和液体培养茎的比较固体培养茎设备简单 使用方便 充分利用培养容器中的养分易选成自我毒害液体培养茎需要一定的设备 有利于外植株的生长避免上述固体培养茎的缺点3. 常见培养茎配方 （参见教材附录2）o 配制培养茎的准备工作（一）、器皿和用具的准备 主要器具：烧杯、容量瓶、移液管、滴管、试管器具的准备： 清洁 烘干（二）、水和药品 水原则上用纯水，一般用蒸馏水即可 化学药品用分析，纯或化学纯（三）、贮备液的配制 1.贮备液的类型 大量元素 扩大1050倍 微量元素 扩大100倍 铁盐 扩大100倍（feso4.7h2o+na2edta）植物生长调节剂 0.5mg/ml 2.贮备液

7、的配制分别称量 溶解 混合 储存三、配制培养茎的方法 少量蒸馏水溶解蔗糖倒入1000ml容量瓶 吸取各种贮备液放入容量瓶 定容 转移到大烧杯与琼脂加热溶解 ph调整 分袋 灭菌 保存备用 无菌技术（一）、无菌室 无菌室的组成：包括无菌操作室和无菌培养室 无菌室的要求：墙壁光滑 地面平坦 门窗密闭 无菌室的灭菌：2新洁尔灭擦洗 75乙醇喷雾 紫外灯照射： 定期使用甲醛和高锰酸钾熏蒸（二）、试材和器具的灭菌1.培养茎的灭菌采用高温高压灭菌锅工作压力为1.1kg/c（120）保质1520min注意排尽冷空气灭菌完毕 冷却 备用2.特殊药品的灭菌高温下易分解和变质的药品过滤除菌：溶液通过孔径为0.20

8、0.45um的过滤网抽滤除菌：用真空泵产生抽力，使溶液通过过滤网3.器皿（具）灭菌常用干热灭菌法工作条件为160/hr注意用牛皮纸等包扎好器皿（具）4.外植体的灭菌（1）75乙醇 润浸和杀菌作用 30s（2）氯化汞 浓度为0.1 510min，无菌水冲洗35次（3）次氯酸钠 浓度210 1530min ，无菌水冲洗35次（三）无菌操作1. 无菌操作前10min先使超净工作台处于工作状态。2. 穿戴好工作衣帽后，用70酒精檫拭双手个工作台面。操作期间，也应在檫拭数次。3. 拨塞前，要用火焰灼热瓶口，用硫酸纸等做瓶盖的，应在火焰附近打开盖子。4. 操作时，试管口应略略向下，避免尘埃杀菌落入管内，又

9、便于操作。第四节 环境条件的操作（一）光照1. 光照时间：1216hr2. 光照强度：10005000/x3. 光照长短（光源）：日光灯（二）温度一般控制在252恒温条件下培养（三）湿度瓶内一般可达到100，避免环境湿度过小，防改瓶内失水（四）汽体避免培养室内存在有氨气体第二章 胚胎培养和离体受精 通过学习，了解胚珠和子房培养，离体受精的胚胎培养技术，理解和掌握胚培养，胚乳培养的胚胎培养技术。第一节 离体胚培养（一）胚培养的意义1. 促使发育不良或中途败育的胚发育成熟分离发育不良的种子或即将败育前的种胚进行培养，促使胚继续发育至成熟，使杂交育种或远保杂交获得成功，特别对于败育胚进行早期离体培养

10、，在遗传和育种上均具有重要意义。2.打破休眠期促进胚萌发对于有休眠期的种子，可通过胚培养。促使休眠种子提早萌发成苗，缩短育种周期或加速繁育良种。3.克服多胚品种珠心胚的干扰具有多胚发育受阻，其珠心胚可以侵入胚囊，使合子胚发育受阻影响杂交育种工作。利用胚胎培养技术，早期分离合子胚培养，排除珠心胚干扰，获得杂种胚。4. 快速繁殖良种胚末5. 诱导胚性愈伤组织离体胚培养的发育途径：按正常胚胎发育途径形成植株合子 球形胚 心形胚 鱼雷形胚 子叶形胚 再生植株胚胎脱分化形成愈伤组织胚“早期萌发”成熟胚的培养：材料的消毒与接种，培养茎，种胚培养的外界条件原胚培养：基本培养茎：ms改良white培养茎；培养

11、茎的渗透应用蔗糖调整，用量在810生长调节：及其它附加物的影响生长调节：种类、浓度、比例附加物：天然提取物第二节 胚乳培养 胚乳培养的用途1. 诱导分化植株，证明细胞全能性的理论。2. 研究胚与胚乳的相生关系，胚乳组织的功能。3. 再生的植株多为三倍体，有可能产生无籽果实。4. 育种和性状遗传规律研究。o 胚乳培养材料的选择：细胞型期o 胚乳愈伤组织的诱导o 器官分化再生植株o 胚乳再生植株的染色体胚性第三章 器官和组织培养器官培养：是植株物某一器官的全部或部分或器官原基的培养组织培养：广义：各种类型外植株的培养。狭义：各种器官组织，以及其培养产生的愈伤组织的培养第一节 茎尖培养茎尖培养：此概

12、念应注意茎尖的含义。 建立无菌材料 茎尖的发育方向及调节1.腋芽萌芽 2.脱分化后产生胚状体 3.脱分化后直接产生不定器官 4.脱分化形成愈伤组织 生根成苗及移栽促进生根的措施：降低基本培养培养基无机茎浓度 调节生长素浓度 添加吸附剂 减少琼脂用量 固相化细胞培养固相化细胞：把细胞固定在一种惰性基质，如琼脂、藻酸盐、纤维或膜上面或里面、细胞不能运动，而营养液可以在细胞间流动，供应其营养。 固相化细胞培养的特点 固相化细胞系统第三节 单细胞培养 单细胞培养：也称单细胞可隆技术，它不是指培养的只有单个细胞，而是指接种的细胞群体中，不存在悬浮培养中所可能存在的小细胞团。而是纯碎的单细胞。个单离细胞不

13、仅仅只是在增殖阶段，它可被诱导再分化，形成完整植株。 单离细胞的方法 单离细胞培养技术方法 培养细胞的密度及生活率的测定第五章 原生质培养与融合 原生质体分离 用以游离原生质的材料来源 酶混合液 游离原生质体的一般技术程序 花粉原生质体的分离第二节 原生质体培养 培养茎 培养方法 原生质体的培养结果及其观察o 原生质体融合：原生质体融合：也称体细胞杂交，就是使分离下来的不同亲本的原生质体之间在人工控制的条件下，象形细胞受精作用那样及相融合为一体。 无机盐诱导融合 聚乙二（peg）与ph的ca相结合的诱导融合方法电融合技术杂种细胞的选择和体细胞杂种的鉴定第 六 章 细胞全能性及其营养代谢 植物细

14、胞全能性 植物细胞全能性：植物细胞具有该植物有机体的全部遗传信息，并具有形成植物有机体所有细胞类型，自然发育成完整植株的能力。 植物细胞全能性的展观和利用 外植体在腋芽萌发等情况下直接发育成苗，还克以在异养条件下脱分化，形成愈伤组织，愈伤组织可以再分化，也可以游离原生质体。用以遗传操作，或游离细胞用以次生物质生产操作的原生质体和细胞均可象愈伤组织一样，实现再分化，再分化可以是胚状体途径。也可是不定器官途径，前者可以用以制备人工种子。胚状体和不定器官均可以种质保存，也均可形成试管苗，用以快速无性繁殖。试管苗方式培育成为进行植物生命周期一样的成年植株，开花结果，完成离体培养周期。第 二 节 培养物

15、的营养 碳源碳源物质以糖类物质最重要。一般的说，蔗糖是最好的糖源，其次是葡萄糖，果糖。糖的浓度一般为24 氯源硝态氮 铵态氮 氨基酸 有机复合物三、无机营养大量元素和微量元素四、维生素vb1 vb6五、生长调节剂生长素类：1aa 1ba naa 2，4d细胞分裂素类： 6ba kt zt zip第三节 培养物的次级代谢 次级代谢概况及生物转化举例 次级代谢的调节1. 初级代谢对此基代谢的调节2. 次级代谢的酶促调节3. 环境因素对次级代谢的调节第七章 外植体的脱分化与生长第一节 外植体脱分化 诱导期间的细胞生物质变化1.气体变换率的增加， 2.rna随体的合成 3.过氧化物酶的增加 4.蛋白质

16、的活跃合成 5.酚类物质的增加 6.乙烯增加第 二节 愈伤组织的生长第三节 悬浮培养细胞的生长 成批培养的细胞生长动态1. 生长周期2. 生长周期中指数生长的数字表述3. 生长周期中的不平衡生长二、连续培养下的细胞生长1长动力学描述2学恒定与浓度恒定 悬浮培养细胞周期第八章 培养物再分化 再分化：是指离体培养物由脱分状态再度分化。再分化可在细胞水平，组织水平和器官水平递进地进行，最后再生完整植株。培养物的再分化，通过胚胎发生和直接分化器官再形成植株这两个途径实现。第一节 细胞分化和组织分化 细胞分化1. 导管分子的分化及其影响因素（1）生长调节剂 生长素 细胞分裂素 其它生长调节剂（2）糖类物

17、质（3）其它理化因子 光的效应 温度的效应 ph2. 细胞分化过程及其机理 组织分化1. 拟分组织：是指培养物中出现的类拟分生组织的细胞群，它是脱分化后的培养物发生的一系列细胞分裂而产生的一团小型、薄壁、液泡小、细胞核和细胞质染色较深的细胞组成，它具分化上的可塑性。2. 维管组织结节：是一个区域的愈伤组织转化为韧皮分子和木质分子的混合体结构，这样的形成层状的细胞向外延伸与拟分生组织连接，形成根原基或牙原基。可以认为维管结节是试管植株的维管束的前力。3. 拟分生组织和维管组织是连接细胞分化和器官分化的“桥梁”第二节 器官分化和植株形成 茎、根器官的分化1. 器官分化的调控1. 控制器官分化的激素

18、模式生长素/激动素，生长素/激动素的相对高水平，有利于根的形成，反之，有利于地上部的形成。在使用中注意二者的种类，浓度及其比例。2. 培养基组分和附加物的作用 提高无机p含量促进器官分化，糖的平衡可逆转生长素/激动素的比例；不加还原氮利于根的形成。一些生理活性物质下可促进培养物的器官发生。3. 物理环境：一般固态培养基有利于器官变化。光对器官分化有重要影响。100015000lx是许多培养物的合适光照。16hr光照符合器官发生要求，连紫外线和蓝光刺激芽的发生，而红光显著地促进长根，一般日光灯提供光源，一般25左右的培养温度。2. 器官分化过程中的生物学和细胞学变化 植株的形成体 发育为植株 具

19、根茎两极器官 植株外植体脱分化 不定器官 单极器官 光茎后根 植株 先根后茎 植株第三节 离体胚胎发生 各种培养类型的离体胚发生1. 对植体直接发生二倍体胚2. 愈伤组织产生胚状体3. 悬浮细胞产生胚4. 单倍体胚胎发生 影响离体胚胎发生的因素1. 外部因素（1）生长调节剂的作用 （2）氮源 （3）其它因子2. 内部因素（1）细胞的隔离 （2）遗传基因型的影响 （3）外植体来源和年龄 （4） 其它因素 离体胚胎发生的机制第九章 培养物的遗传与变异第一节 培养细胞变异 培养细胞高频率变异的起因1. 原来具不同检型的细胞杯诱导分裂2. 培养条件引起新的异样 培养细胞变异的遗传机理1. 染色体断裂，

20、染色体数增加2. 染色体断裂，染色体数减少3. 染色体断裂，并引起染色体数改变4. 染色体断裂，但并不引起染色体数目的变化5. 体细胞核内再复制6. 单个核基因的突变7. 转座子的作用8. 花粉植株的遗传变异 花粉植株的遗传稳定性问题 花粉植株的变异 单倍体植株的减数分裂分析o 体细胞融合体的遗传变异 异核体的和染色体形成o 核分裂同步、核融合，且亲本的染色体未出观不亲和观象o 核分裂同步（相同或互影响后同步）核融合，但在不同培养期发生染色体变化（染色体重组或丢失）。o 核不融合，且两个核间重又产生新膜、两个子细胞的以后各自分裂。o 核不融合，形成多核细胞。细胞周期混乱 胞质基因组的分裂与重组

21、第十章 离体培养离体繁殖：也称微型繁殖或快速无性繁殖，是农业生物技术重要组成之一，在农业生产上应用最广泛的一个领域。 离体繁殖的特点及其应用（一）离体繁殖的特点1繁殖速度快2. 占用空间小3. 便于种质贮存和交换4. 离体繁殖诱变5. 培育无病毒苗 离体繁殖在园艺上的应用第二节 外植株的类型与发育途径 外植体的类型传统的良种繁殖器官组织 外植体发育的途径1.腋芽的萌发外植体培养中最普遍的是诱发腋芽萌发生长。腋芽的繁殖系数不仅受腋芽萌发数目限制，同时与续代培养的时间长短有关。续代时间短、繁殖系数则高。2、不定芽的产生不定芽来自原基或分生组织等，直接分化成芽苗。3.离体胚胎发生胚状体具有胚芽和胚根

22、的两极原基。胚胎发育可形成完整植株，因此是最快的植株再生途径，也是外植体增殖系数最大的发育途径。第三节 离体繁殖的技术与方法 无菌材料的建立（一）材料的选取1.必须选取优良的母株 2.种源可靠 3.性状稳定 4.生长健壮 5.成年的母株，切忌用实生苗繁殖良种（二）材料的灭菌1.消毒前，去掉外植体表面带菌鳞片及过多的枝叶，然后用肥皂水冲洗2.采用水培材料3二次消毒法即材料用消毒剂处理后，用清水冲洗再用低浓度次氯酸钠冲洗一次立即接种4. 添加抗菌剂或吸杀菌剂进行消毒5. 还应注意防治褐变（三）培养茎一般建立无菌株原的培养基多采用white或ms培养基，并附加低浓度的生长素或细胞分裂素，诱导无菌材料

23、建立繁殖系，初步续代培养，扩大繁殖材料二、培养材料的增殖是良种无性快繁的重要环节。增殖的结果要求提供大量的遗传性稳定，整齐一效的种苗。因此，须考虑以下几个因素（一）增殖的方式增殖的方式有四种途径，即腋芽的萌发，产生不定根和胚胎发生以及原球茎增殖途径（二）增殖的培养基及附加物1.增殖的基本培养茎 2.植物生长调节剂（三）增殖培养的其它因素1.增殖体的大小与续代培养的间隔2培养的光照与温度：温度为25左右 光照为12hr四、增殖培养注意事项1.芽苗的变异 2.玻璃苗的控制 提高琼脂的浓度降低细胞分裂素浓度培养基添加低浓度多效唑三、苗芽生根培养（一）基本培养基诱导生根的基本培养基，需降低无机盐浓度，

24、有利于根的分化，一般用1/2或1/4ms 培养的大量元素（二）生长调节剂 通常不用细胞分裂素，添加低浓度的生长素。 （三）其他附加物 1.添加活性炭有利于生根，2.间苯三酚等有利于生根，3.生根培养的温度一般要比芽增殖所需温度略低一些。四、小苗移驯化试管苗的移植是从“异养”到“自养”的转变，需要有一个逐步适应的过程。移植之前，试管苗必须提高光强进行炼苗，同时进一步将瓶口包扎物打开进行炼苗。移植时，首先把附着干根部的琼脂冲洗干净，同时注意避免根茎部破伤。移苗的土壤要求保水，透气，以利小苗生长。移植的小苗注意温度和光照的驯化，即温度逐渐降低，光照强度逐步加强。第四节 人工种子的研制 研制人工种子的

25、意义o 概念狭义：将植物离体培养中产生的胚状体，包裹在含有养分和具有保护功能的种皮中，在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。广义：人工种子包括胚状体、芽体及小鳞茎，用凝胶包裹成球体或块状或其他形状的种物。 意义 人工种子制作方法及其程序o 研制流程体细胞胚胎发生体细胞胚胎同步化体细胞胚分选体细胞胚包裹人工胚乳包裹外膜种子贮存种子播种萌发。 体细胞胚的发生系统1.人工种子对胚状体的要求2.胚状体的发生与同步化的筛选 控制培养茎成分及激素；密度梯度离心法进行大小胚分离筛选；过滤分选或仪器分选法等等。o 人工种皮一般是指人工种子中胚状体及其类似物以为的部分的统称。以海藻酸钠、明胶、树胶、gelrite为

26、最佳，包制人工种子的方法有：干燥法、离子交换法和冷却法。 人工种子贮存第十一章离体培育无病毒苗第一节培育无病毒苗的意义 园艺植物病毒病的严重性 脱出病毒的研究概况1. 化学杀菌剂.种子繁殖.热处理 离体培养脱毒的意义离体培养脱毒是园艺植物生产中的重要环节，是常规良种繁殖的一个重要程序。第二节脱除病毒的方法 茎尖分生组织脱毒原理1. 茎尖培育脱毒原理病毒在植株上的分布是不均一的，在幼嫩的组织比成熟的组织含量低。茎尖分生组织几乎不带毒。其原因为：1. 分生组织的细胞生长速度快，病毒在植物体内繁殖的速度相对较慢；1. 病毒的传播是靠筛管组织进行转移。或通过细胞间连续传递给其他细胞，因此病毒的传递扩散

27、也受到一定影响。1. 茎尖脱毒的方法关键是茎尖的大小，即要考虑脱毒效果，又要注意茎尖离体培养的成活率。一般切取0.20.5mm，带12个叶原基的茎尖作材料。为了提高效率，可与热处理结合使用。 脱毒菌的鉴定 无病毒株原的鉴定1. 指示植物鉴定法1. 抗血清鉴定法1. 电子显微镜检查法 脱毒苗农艺性状鉴定1. 通过不同途径脱毒处理，可能导致良种种性的改变。1. 无病毒鉴定后，必须进行田间农艺性状鉴定，才能应用。1. 脱毒苗的农艺性状鉴定必须在隔离的环境条件下进行。1. 脱毒苗鉴定图的任务：1. 选择与亲本相同的优良经济性状的植株1. 淘汰非亲本性状的劣质植株1. 发现不同于亲本的优良性状的突变系。

28、1. 对可脱毒苗后代新生系的选择材料，还有必要作进一步的抗性鉴定等等。 无病毒原种的保存和应用 无病毒原种的保存1. 隔离种植保存1. 自然环境进行隔离种植保存1. 采用隔风网室（300目沙网）种植保存。1. 离体保存 无病毒原种的应用1. 无病毒原种的繁殖：建立严格的原种繁育制度，防治病毒在感染。1. 无病毒原种的推广 可以参照新品种反之推广制度，特别注意采取严密的防止病毒重复翻然的有关措施，才能取设预期的效果。第十二章离体保存种质资源 离体保存种质的意义 种子（种植）保存法的局限性1. 种子的生活力随贮存物的延长逐渐丧失；1. 无性繁殖的植物难以用种子保存；1. 种子贮存易遭受自然灾害而丢

29、失；1. 种植保存需大量土地，花费巨大的人力、物力进行管理，但易受病虫害而毁坏，也不便于种质交换 试管保存的优点1. 试管内保存无性系，占用空间小，可贮存大量种质资源；1. 可以排除病虫，便于国际种质交流1. 生产上需要可立即进行快速大量繁殖1. 保存费用低廉。 限制生长保存方法 培养基添加生长抑制剂 提高培养基渗透区 降低培养瓶内氧分区 培养物干燥保存o 中低温调控生长保存一般用19低温保存外体或结合提交培养基渗透区。该方法是用于保存中短期的种植材料。 超低温保存种质 超低温保存的基本原理和主要环节液氮中几乎所有细胞的代谢活动，生长过程停止了，仅保存细胞的活动和形态发生的潜能，排除细胞的遗传

30、变异。 超低温保存技术1. 保存材料的选取1. 冷冻前材料的预处理1. 添加冷冻防护剂1. 材料冷冻的方法1. 材料保存1. 保存材料解冻1. 保存材料复苏培养第十三章离体培养在品种改良上的应用 培养细胞变异系的利用 自发变异系的利用在离体培养中，变异细胞可高频率的表现出来。只要加以一定分离选择，就可以利用变异系进行品种改良。 培养细胞的人工诱发突变1. 诱变剂类型及其处理1. 细胞突变体的分离筛选方法 直接选择法 间接选择法1. 有应用潜力的突变系的选择和利用1. 涉及优质，高产等性状的突变系1. 抗性突变系1. 抗氨基酸及其类似物，嘌哈和嘧啶类似物的突变系2. 遗传转化转化：该词原是指一个细菌品系由于吸收了另一个细菌品系的nda而发生遗传性状改变的现象。现在一般认为：凡外源nda导入细胞的过程都可指转化，包括用原生质体融合的方法