实验八、氨基移换反应一血清谷丙转氨酶活性的测定

1、血清谷丙转氨酶活性的测定（分光光度法）n 【目的要求】n 1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。n 2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作方法。n 3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。【原理】生物机体内转氨基作用是-氨基酸的氨基通过酶促作用转移到酮酸的酮基位置上，生产相应的酮酸和氨基酸的化学反应。催化这反应的酶称为转氨酶（transaminase），其辅酶为磷酸 吡哆醛。转氨酶广泛存在于机体的各种组织中，在肝、心、肾等组织中的谷丙转氨酶（glutamic pyruvic transaminase , GPT），谷草转氨酶（glutamic oxalacetic transamina

2、se , GOT）活性较高。在正常的新陈代谢过程中，血清内维持一定水平的转氨酶活性（即正常值）。当肝、心、肾等组织发生病变时，由于组织细胞肿胀，坏死导致大量的酶释放至血流中，从而引起血清谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）活性显著升高。因此测定这些酶的活性对某些疾病的临场诊断具有重要的参考价值。n 血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37、pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与-酮戊二酸生成谷氨酸和酸：生成的酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加成反应，生成酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与酸的生成量，亦即与

3、ALT活性的高低成正比关系。据此与同样处理的酸标准液相比较，便可算出或通过标准曲线查清中ALT的活性。谷丙转氨酶活性单位：每毫升血清在 37与 pH7.4 的基质液作用 60min，生成 1mol酸为一个单位。临床检验取血清量为0.1mL，报告数据以 100mL 血清计算，因此当 GPT200U/100mL。试剂与器材n 1、样品动物或人血清n 2试剂1) 甲液（1/15 mol/L 磷酸氢二钠溶液）称取磷酸氢二钠（Na2HPO4，A. R.）9.47g 或含十二水磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O，A. R.）23.87g溶于蒸馏水中定容至1000mL。2) 乙液（1/15 mol/L 磷

4、酸二氢钾溶液）称取磷酸二氢钾（KH2PO4，A. R.）9.078g溶于蒸馏水中定容至1000mL。取甲液825mL+乙液175mL 混合=磷酸缓冲液PH应为7.4。3) GPT 基质液（底物）称取酮戊二酸29.2mg（2mmol/L）及DL丙氨酸1.78g（200 mmol/L）溶于50mL pH7.4 的磷酸缓冲液中，加0.1 mol/L NaOH溶液约0.5mL，调节 pH为7.4，然后加磷酸缓冲液定容至 100mL。加少许氯仿防腐，置冰箱中保存。n 4) 2，4二硝基苯肼（1mmol/L）称2，4二硝基苯肼19.8mg。溶于100mL 1mol/L盐酸中，使其溶解。n 5) 酸钠标准液

5、精确称取酸钠22mg。加磷酸缓冲液溶解后定容至100mL。此溶液浓度为2mol/mL，临用前配制。p 6) 0.4mol/L NaOH 溶液p 3、器材试管及试管架，移液器（0.05ml，0.1-1ml）， 量筒（10 mL，100 mL），恒温水浴，722 型分光光度计，坐标纸。实验内容和步骤n 1)制备标准曲线2)绘制标准曲线n 以光吸收值为纵坐标，酶活性单位数为横坐标，在坐标纸上绘制各测得A520值与对应的酶活性单位数的标准曲线。1. 为什么在制作标准曲线时要加入底物溶液2. 为什么加入底物溶液的体积不同，对反应没有影响3. 怎么计算酸的质量A52050酸微克数-吸光度标准曲线4540y

6、 = 117.08x - 0.7333530252015105000.050.10.150.20.250.30.350.4-53)样品测定2 酶活力测定：洁净干燥试管2支，即1号测定管、2号对照管试剂测定管对照管SALT底物溶液，ml0.50.537水浴10min血清，ml0.1-37水浴60min2,4-二硝基苯肼溶液， ml0.50.5血清，ml-0.10.4mol/L NaOH溶液，ml5.05.0室温下静置30minA520nm光吸收值1、样品测定为什么要使用对照管？2、样品测定的酶反应怎样终止？3、血清样品和底物在使用前最好提前放置于水浴中预热，保证反应时的温度的准确性。4、反应温度

7、和计时要准确结果计算n 标准曲线测定法根据样品管 A520 值查标准曲线，得出酸的微摩尔数（1微摩代表1单位活力），计算即得每 100mL 血清中转氨酶活性单位数。比色测定法，如：金氏法（King法）、穆氏法（Mohun 法）和赖氏法（Reitman-Frankel法）。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全相同。不同之处在于作用时间：King法60min ，Mohun法和 Reiman法30min。因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同。King法单位定义是：每1ml血清在37条件下与底物作用60 min，生成1mol酸称为一个单位。 Mohun 法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37

8、条件下与底物作用30 min，每生成2.5微克酸为1单位。赖氏法没有制定自身的单位定义，而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的。1个卡门氏单位的定义是：在温度25，pH7.4，波长340nm，光径1cm的条件下，1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。可见卡门氏单位不是用物质的量浓度，而是用物 质的吸光度表示酶的活性单位的。若将卡门氏单位的定义条件代入国际单位计算公式，即得卡门氏单位与国际单位的换算关系：1卡门氏单位=0.4821 IU/L(25)，便可将卡门氏单位兑换成国际单位。注意事项1) 为防止溶血及其他因素对酶活性测定的影响，实验过程所用的一切器皿（注射器、试管等）应清洗干净，干燥后方能使用。2) 空腹取血，避免血脂干扰。迅速分清，及时测定。3) 作为标准物质的酸钠极