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1、生物信息软件综合实践第五章多序列对位排列和进化分析多序列对位排列Multiple Sequence Alignment (MSA)chicken xenopus human monkey dog hamster bovineguinea pigPLVSS-PLRGEAGVLPFQQEEYEKVKRGIVEQCCHNTCS ALVSG-PQDNELDGMQLQPQEYQKMKRGIVEQCCHSTCS LQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICS PQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICS LQVRDVELAGAPGE

2、GGLQPLALEGALQKRGIVEQCCTSICS PQVAQLELGGGPGADDLQTLALEVAQQKRGIVDQCCTSICS PQVGALELAGGPGAGGLEGPPQKRGIVEQCCASVCSPQVEQTELGMGLGAGGLQPLALEMALQKRGIVDQCCTGTCTN S N N NNESBring the greatest number of similar characters into the same column of the alignmentYCN YCN YCN YCN YCN YCN NYCNYCNLYQLE LFQLE LYQLE LYQLE L

3、YQLE LYQLE LYQLRHQLQ为什么要做MSA？用于描述一组序列之间的相似性关系，以便了解一个基因 的基本特征，寻找motif，保守区域等。用于预测新序列的二级和三级结构，进而推测其生物学功能。Human Hox genes为什么要做MSA？Nature 423, 241-254不同种的酵母Gal1和Gal10 启动子区MSA为什么要做MSA？用于描述同源序列之间的亲缘关系的远近，应用到分子进化分析中。是构建分子进化树的基础。AaSpecies treeGene treeBbCcWe often assume that gene trees give us species trees

4、注意概念：Paralogy（旁系同源/并系同源）& Orthology（直系同源）Paralogy（旁系同源/并系同源）& Orthology（直系同源）Orthologs：物种形成过程中源自同一祖先，通常功能保守Paralogs：基因组内基因复制产生，较易发生功能分化为什么要做MSA？不同物种基因组范围的MSA能分析基因组结构变异和共线性Nature 423, 241-254为什么要做MSA？Contig assembly怎么做MSA？ 动态规划算法（dynamic programming）：MSA 改进算法（启发式算法）：1. 渐进法（progressive methods）：Clusta

5、l, T-Coffee,MUSCLE2. 迭代法（iterative methods）：PRRP, DIALIGN3. 其它算法：Partial Order Algorithm、profile HMM、meta-methods (MAFFT)/wiki/List_of_sequence_alignment_softwareCurrent Opinion in Structural Biology 2006, 16:368373两条及三条序列的动态规划算法SAAN SVSNSStartVSN S SNAS A五条长度为200-250aa的蛋白质序列使用

6、动态规划比对需要运算超过12小时Clustal使用方法u Clustal：目前被最广泛应用的MSA 方法u 可在线分析u 可在本地计算机运行u 序列输入、输出格式InputFASTANBRF/PIR EMBL/SWISSPROT ALNGCG/MSF GCG9/RSF GDEOutputALN NBRF/PIR GCG/MSF PHYLIP NEXUS GDE/FASTAsequence 1ATTGCAGTTCGCA sequence 2 ATAGCACATCGCAsequence 3 ATGCCACTCCGCCClustal W/X算法基础两 两 比 对 构建距离矩阵构建指导树（guide

7、tree）将距离最近的两条序列用动态规划的算法进行比对；“渐进”的加上其他的序列“渐进”比对（Progressive alignment）粘贴或上载序列u Clustal在线分析方法（ClustalW）EBI的ClustalW分析网页http:/www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/帮助文档 http:/www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/help/调整参数u Clustal在线分析方法（ClustalW）u Clustal离线分析方法（ClustalX） 下载安装自带Help文件Using ClustalX for multipl

8、e sequence alignmentby Jarno Tuimala两种工作模式: Multiple Alignment Profile Alignment第一步：输入序列FileLoad sequences注意：该软件不能识别中文。因此序列不能位于XP系统的桌面， 应放于C:或D:等纯英文路径下。 第二步：设定比对参数第三步：进行序列比对第四步：比对完成，选择结果文件的保存格式conserved residuesconservation profileu 可进一步对排列好的序列进行修饰（1）Boxshade突出相同或相似位点（/softwar

9、e/BOX_form.html）在EBI ClustalW结果网页复制序列比对结果在“Boxshade”网页粘贴序列，在“Input sequence format”栏目选择“ALN”，在“Output format”栏目选择“RTF_new”在结果网页点击“here is your output number 1” 修饰过的排列结果u 可进一步对排列好的序列进行修饰（2）ESPript多种修饰 功能，突出相同或相似位点http:/espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi在EBI ClustalW结果网页下载“Alignment file”(ALN

10、文件)在ESPript分析网页“Aligned Sequences”栏上载ALN文件在“Output layout”和“Output file or device”栏选择 修饰后的比对结果u 可进一步对排列好的序列进行修饰（3）GeneDoc/gfx/genedocFile Import选择输入文件的格式（如ALN）修饰排列结果2. 系统发生分析（Phylogenetic analysis)u 分析基因或蛋白质的进化关系u 系统发生（进化）树（phylogenetic tree）A tree showing the evolutionary relatio

11、nships among various biological species or other entities that are believed to have a common ancestor.研究系统发生的方法经典进化生物学：比较：形态、生理结构、化石分子进化生物学：比较DNA和蛋白质序列An Alignment is an hypothesis of positional homology between bases/Amino AcidsResidues that are lined up in different sequences are considered to sha

12、re a common ancestry (i.e., they are derived from a common ancestral residue).Easyonly with substitutionsDifficultalso with indels系统发生树术语末端节点分支BranchA可以是物种，群体，或者蛋白质、DNA、RNA分子等OTUB节点NodeCD祖先节点/ 树根RootE内部节点/分歧点该分支可能的祖先HTU= (A, (B,C), (D, E)Newick format系统发生树术语A clade（进化支） is a group of organisms thati

13、ncludes an ancestor and all descendents of that ancestor.分支树Cladogram时间度量树Ultrametric tree进化树Phylogram6Taxon BTaxon BTaxon CTaxon BTaxon C11Taxon C31Taxon ATaxon ATaxon A5Taxon DTaxon DTaxon Dgenetic changeno meaningtime系统发生树术语进化树分支的长度Scaled branches : the length of the branch is proportional to the

14、 number of changes.The distance between 2 species is the sum of the length of all branches connecting them.系统发生树术语Rooted tree vs. Unrooted tree无根树AC有根树DBtwo major ways to root trees:By midpoint or distanced (A,D) = 10 + 3 + 5 = 18Midpoint = 18 / 2 = 9A10C322BD5outgroup外群、外围支系统发育树构建步骤多UPGMA最大简约法(maxi

15、mum parsimony, MP)邻近法距离法(distance)最大似然法(Neighbor-joining, NJ)最小进化法(minimum evolution)(maximum likelihood, ML)贝叶斯法(Bayesian inference)统计分析BootstrapLikelihood Ratio Test进化树评估建立进化树选择建树方法（替代模型）序列比对（自动比对、手工校正） 距离法距离法又称距离矩阵法，首先通过各个序列之间的比较，根据一定的假设（进化距离模型）推导得出分类群之间的进化距离，构建一个进化距离矩阵。进化树的构建则是基于这个矩阵中的进化距离关系 。计算

16、序列的距离，建立距离矩阵Rat通过距离矩阵建进化树CowCatCatDogRat21 1DogRat34524Cow676DogStep1. 计算序列的距离，建立距离矩阵对位排列， 去除空格（选择替代模型）Uncorrected “p” distance(=observed percent sequence difference)Kimura 2-parameter distance(estimate of the true number of substitutions between taxa)Step2. 通过矩阵建树由进化距离构建进化树的方法有很多，常见有：1. Unweighted

17、Pair Group Method with Arithmetic mean (UPGMA)2. Neighbor-Joining Method (NJ法/邻位连接法)3.Minimum Evolution (MP法/最小进化法)最大简约法 (Maximum Parsimony)最大简约法（MP）最早源于形态性状研究，现在已经推广到分子序列的进化分析中。最大简约法的理论基础是奥卡姆（Ockham）哲学原则，对所有可能的拓扑结构进行计算，找出所需替代数最小的那个拓扑结构，作为最优树。Find the tree that explains the observed sequences with a

18、 minimal number of substitutionsMP法建树流程PositionT T AAG A GAC C GGSequence1 Sequence2 Sequence3Sequence4If 1 and 2 are grouped a total of four changes are needed.If 1 and 3 are grouped a total of fivechanges are needed.If 1 and 4 are grouped a total of six changes are needed.Position 3(1,2): 1 change

19、;(1,3) or (1,4): 2 changesPosition 2(1,3): 1 change;(1,2) or (1,4): 2 changesPosition 1(1,2): 1 change;(1,3) or (1,4): 2 changes123MP法建树步骤654BEST 最大似然法 (Maximum Likelihood)最大似然法(ML) 最早应用于对基因频率数据的分析上。其原理为选取一个特定的替代模型来分析给定的一组序列数据，使得获得的每一个拓扑结构的似然率都为最大值，然后再挑出其中似然率最大的拓扑结构作为最优树。CCAGATATGCGCML法建树流程Inferring

20、 the maximum likelihood treePick an Evolutionary ModelFor each position, Generate all possible tree structuresBased on the Evolutionary Model, calculate Likelihood of these Trees and Sum them to get the Column Likelihood for each OTU cluster.Calculate Tree Likelihood by multiplying the likelihood fo

21、r each positionChoose Tree with Greatest Likelihood构建进化树的新方法贝叶斯推断(Bayesian inference)Holder&Lewis (2003) Nature Reviews Genetics 4, 275-284Bayesian inference:Maximum Likelihood:What is the probability that the model/theory is correct given the observed data?What is the probability of seeing the obse

22、rved data (D) given a model/theory (T)?Pr(T|D)Pr(D|T)与ML相比，BI的优势： Speed No need for bootstrappingComparison of MethodsDistanceMaximumparsimonyMaximum likelihoodUses only pairwise distancesUses only shared derived charactersUses all dataMinimizes distance between nearest neighborsMinimizes totaldista

23、nceMaximizes tree likelihood given specific parameter valuesVery fastSlowVery slowEasily trapped in local optimaAssumptions fail when evolution is rapidHighly dependent on assumed evolution modelGood for generating tentative tree, or choosing among multiple treesBest option when tractable (30 taxa,

24、homoplasy rare)Good for very small data sets and for testing trees built using other methodsChoosing a Method for Phylogenetic PredictionMolecular Biology and Evolution2005 22(3):792-802Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, 2nd edition, by David W. Mount./cgi/cont

25、ent/full/2008/5/pdb.ip49p254 评估进化树的可靠性自展法（bootstrapping method）A statistical technique that uses intensive random resampling of data to estimate a statistic whose underlying distribution is unknown. 从排列的多序列中随机有放回的抽取某一列， 构成相同长度的新的排列序列 重复上面的过程，得到多组新的序列 对这些新的序列进行建树，再观察这些树与原始树是否有差异，以此评价建树的可靠性The Bootstr

26、ap Computational method to estimate the confidence level of a certain phylogenetic tree.Pseudo sample 10011222345Sample0123456789GAGGCTTATCrat human turtle fruitfly oakduckweedGGAAGGGGCT GGTTGGGGCT GGTTGGGCCC CCTTCCCGCC AATTCCCGCTAATTCCCCCTrathuman turtle fruitfly oakduckweedGTGGCTTATC GTGCCCTATG CT

27、CGCCTTTG ATCGCTCTTGATCCCTCCGGPseudo sample 24455567778CCTTTTAAATCCTTTTAAATrathumanrat human turtle fruit fly oakduckweedturtle fruitfly oakduckweedCCCCCTAAAT CCCCCTTTTT CCTTTCTTTTCCTTTCCCCGMore replicates (between 100 -1000)Inferred tree自展法检验流程Bootstrapping doesnt reallyassess the accuracy of a tree

28、,only indicates the consistency othe data对ML法而言，自展法太耗时，可用aLRT法检验进化树的可靠性Anisimova&Gascuel (2006)Syst. Biol. 55(4):539-552u 看图工具TreeView进化树编辑打印软件（在http:/taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html）EBI的ClustalW2-phylogeny分析网页输入比对后的序列（或上载ALN文件）下载“Phylip tree file”（ph文件）用TreeView软件打开上述文件可以不同格式展示进化树（1、2、

29、3）分子进化分析软件PHYLIP/phylip.html免费的集成进化分析工具PAUP/商业软件，集成的进化分析工具MEGA/免费的图形化集成进化分析工具，最新版包括了MLPHYMLhttp:/atgc.lirmm.fr/phyml/最快的ML建树工具PAMLhttp:/abacus.gene.ucl.ac.uk/software/paml.htmlML建树工具Tree-puzzlehttp:/www.tree-puzz

30、le.de/较快的ML建树工具MrBayes/基于贝叶斯方法的建树工具更多工具/phylip/software.htmlu 分子进化树构建方法/提供最大似然法（ML）、最大简约法（MP）和距离法三种建树方法。其中距离法包括邻接法（NJ）、最小进化法（ME）和UPGMA三种算法。优点：图形界面，集序列查询、比对、进化树构建为一体，帮助文件详尽，免费缺点：ML法较慢（如序列较多可考虑用PHYML）最新版本（MEGA6）Pig gi

31、|218855168|gb|ACL12051.1| FAD24 pr9298Cattle gi|146186885|gb|AAI40653.1| NOC3L100Human gi|18389433|dbj|BAB84194.1| AD24 HMouse gi|18389431|dbj|BAB84193.1| AD24 MChicken gi|118092837|ref|XP 421670.2| PRZebrafish gi|50838808|ref|NP 001002863.10.02OsDR10OsDR10-O.rufipogonA分析举例87 OsDR10-9311AOsDR10-Nipp

32、onbareAOsDR10-O.rufipogonB91OsDR10-Nackdong OsDR10-9311BOsDR10-NipponbareB5289OsDR10-O.punctataOsDR10-O.latifolia95OsDR10-O.australiensisOsDR10-L.tisserantii95OsDR10-L.JX0.005Phylogenetic analysis of the coding regions of OsDR10 and its homologs from different species. The tree was constructed by ne

33、ighbour-joining method. The numbers for interior branches indicate the bootstrap values (%) for 1,000 replications. The scale at the bottom is in units of number of nucleotide substitutions per site.Xiao et al. PLoS ONE 4:e4603 (2009)MSA是构建分子进化树的关键步骤MSA程序可对任何序列进行比对，选择什么样的序列进行比对非常重要！用于构建进化树的序列必须是同源序列

34、3.上机操作1. 在基因重组人胰岛素面市之前，糖尿病患者所需胰岛素主要来 自屠宰场的动物胰脏。请分析来源自猪、牛和羊的胰岛素哪一种最适于人使用，说明理由。四种蛋白的注册号分别是AAA59172（人）, AAQ00954（猪），AAA30722（牛）和P01318（羊）。2. Keratin是一种微管蛋白，有type I 和 type II两种类型，在染色体上成簇分布，对上皮细胞的正常结构十分重要。请根据人类type II keratin 2p（CAD91891）对NCBI Homo sapiens RefSeqprotein序列数据库的BLASTP检索结果（/Blast.cgi?CMD=Get&RID=HH241 XTA014），下载人