关于人-鼠嵌合抗体制备的可行性

1、关于人 - 鼠嵌合抗体制备得可行性一、概述人 -鼠嵌合抗体 ,即抗体得可变区来自鼠单克隆抗体，而恒定区则来自人得抗体。它就是通过从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因,与人 Ig 恒定区基因连接 ,插入适当表达载体 ,转染宿主细胞表达产生。 嵌合抗体既保留了亲本抗体特异性结合抗原得能力，又大大减少了鼠源性在人体内得免疫原性，其半衰期明显延长,且在介导 C C 及 DCC 方面亦明显增强。二、市场分析附表就是中国 FDA 批准上市与进入临床得治疗型单抗药物抗体名称厂家靶抗原抗体类型适应症研发阶段Muromonab CD3强生D-鼠源抗移植排斥批准上市 ituxi a罗氏CD-20嵌合B 细胞非霍奇金

2、批准上市淋巴瘤 rastzu ab罗氏H 2人源化乳腺癌批准上市Ba iliximab诺华D 5嵌合抗移植排斥批准上市T atuzum b基因泰克 ER-2人源化乳腺癌批准上市O T3武 汉生 物 制品研D-3鼠源抗移植排斥批准上市究所抗人 IL 8 单克隆抗体乳东 莞宏 远 逸士生IL 鼠源银屑病批准上市膏物公司重组人源化抗人表皮因百 泰生 物 药业公人 表 皮 因 子人源化上皮源性肿瘤批准上市子受体单克隆抗体注射司受体液碘 131I 美妥昔单抗注成都华神集团， 第鼠源肝癌批准上市射四军医大学碘 13 I人鼠嵌合型肿上 海美 恩 生物技嵌合抗肿瘤批准上市瘤细胞核单克隆抗体注术公司射液重组人型

3、肿瘤坏死因上 海中 信 国健药肿 瘤 坏 死 因人源化银屑病与 强直性批准上市子受体抗体融合蛋白业公司子脊柱炎鼠抗人 T 淋巴细胞 C3济 南天 康 生物制 3鼠源抗移植排斥临床研究表面抗原单克隆抗体品公司注射用抗肾病综合症出武汉生物制品所，鼠源出血热临床期血热 病毒单克 隆 抗体 (I第四军医大学型）抗人肝癌单抗Hep 中科院细胞所鼠源肝癌临床研究a 抗乙型脑炎单抗北京生物制品所,第四军医大学注射用重组人型肿瘤上 海美 恩 生物公坏死因子受体-抗体融合司蛋白鼠源乙型脑炎临床研究嵌合肿瘤临床研究目前国内上市得单抗药物有1个 ,其中 5 个就是国外进口产品， 我国上市得自行开发得治疗性单抗药物得

4、有6 个，处于临床研究阶段得有5 个 (表6)。其中 ,武汉生物制品研究所抗肾移植单抗OKT3(注射用鼠源性抗人T 淋巴细胞C 3抗原单克隆抗体）,也就是最早批准上市得国内自行研制得抗体，具有免疫抑制作用，可逆转对移植器官得排斥反应;由北京百泰生物药业有限公司与古巴合作开发得I 类癌症治疗新药“重组人源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体 ”(商品名：泰欣生）于200年月11 日获得国家I 类新药证书 .这就是我国批准得第一个人源化单克隆抗体药物，它得问世标志着我国在癌症靶向治疗与人源化抗体药物领域取得重大突破，该药主要用于治疗头颈部、食管、肺部、乳腺、结直肠等部位得上皮源性肿瘤 ;由第四军医大学

5、、成都华神集团股份有限公司联合研制得碘1美妥昔单抗注射液（商品名:利卡汀） ,于 20 5 年 4 月 0 日获得国家类新药证书。这就是全球第一个用于治疗原发性肝癌得药物，也就是我国第一个具有自主知识产权得抗体类药物。三、应用嵌合抗体目前主要用于药物治疗方面，与鼠抗相比,嵌合抗体既保留了鼠源可变得高亲与性，又具有人Fc 段得多种免疫杀伤功能,从而大大降低了人抗鼠抗体反应得发生几率,改善了临床治疗效果，与其它小分子基因工程抗体相比,嵌合抗体作为完成得抗体分子,在体内半寿期更长，并具有人F段得多种免疫杀伤功能.四、技术路线从杂交瘤细胞中提取总RNA反转录合成cDNA扩增轻链、重链得V 区基因克隆、

6、测序分析插入含信号肽及人Ig 重链、轻链 C 区基因得真核表达载体酶切鉴定、测序分析转染 Sp2/0 细胞检测抗体特异性与人源性制备腹水生产抗体五、材料与仪器1 材料大肠杆菌 DH ，大肠杆菌感受态细胞，T A 克隆载体 -Easy Ve tor,含信号肽及重链、轻链恒定区基因得质粒 pAc - H ,分泌单抗得杂交瘤细胞 ,真核表达载体pc NA3 、，小鼠骨髓瘤细胞 Sp2/0。2 主要试剂氨苄西林钠 ,限制性内切酶,DN 连接酶， q NA 酶， T i ol R提取试剂盒，反转录CR 试剂盒，琼脂糖，嗅化乙锭(）， dN P， NAMa ker,DNA 凝胶回收试剂盒， 质粒抽提试剂盒

7、,胎牛血清 ,无血清培养液,二甲亚砜（DMSO ），转染试剂盒pof cta ineTM200， M X, 抗原，羊抗人I G Fc 片段 -HRP 酶标抗体。3 主要仪器低温高速台式离心机 ,恒温摇床，恒温水浴箱 ,水平式电泳仪， PCR 扩增仪，紫外分光光度计，紫外透射仪， O2 培养箱，倒置显微镜 ,洁净工作台 ,酶标仪。六、关键技术与方法1 可变区基因克隆、 1R A 提取及反转录取对数生长期得杂交瘤细胞株约7 个细胞，按照 rizol RNA 提取试剂盒得说明书抽提细胞得总 RNA, 再进行 T PR 扩增 ,回收纯化扩增产物备用 .1、 2扩增轻链、重链得 V 区基因根据 Or n

8、d等（ 1989) 设计得扩增小鼠可变区基因得引物,以上述扩增产物为模板扩增抗体基因得可变区。回收重链VH （约 3 0 b）、轻链 V ( 约 30 bp)片段，插入 T asy 载体 ,各送份样品测序。测序所得序列在G e nk 核酸数据库中进行分类及同源性分析。两端加入酶切位点根据上述 P R 产物序列设计含酶切位点得引物，再次进行扩增，以使抗体可变区基因片段具有与载体相吻合得酶切位点，便于插入表达载体。回收纯化扩增产物备用。2 嵌合抗体表达载体构建改造含信号肽及人I 重链与轻链C 区基因片段得单克隆位点设计含重链信号肽起始位点序列及酶切位点Nhe 得上游引物 HLF(KO AK+4 ,

9、即 GCCGCC AT G)，与含 h位点得下游引物H R，以质粒 A CH3为模板 ,扩增出重链信号肽基因片段;设计含 Xho 与 n 位点上游引物 HC ,与含 u in（ RK R）序列及酶切位点ba 得下游引物H R,以质粒 pA C 3 为模板 ,扩增出重链恒定区基因片段片段;用 Xho 连接上述片段得到含重链信号肽、 CS及重链恒定区得基因片段。设计含酶切位点 pa 得上游引物 LLF, 与含 oR 位点得下游引物LLR, 以质粒 pA -CH3 为模板，扩增出轻链信号肽基因片段；设计含 Eo 与 nd 位点上游引物C ,与含Pme 得下游引物LCR ，以质粒Ac H3为模板，扩增

10、出轻链恒定区基因片段片段;用EcoR连接上述片段得到含轻链信号肽、MCS及轻链恒定区得基因片段.构建含信号肽及人Ig 重链与轻链C 区基因片段表达空载体用合成得含酶切位点（Xb 与 Apa )得 2A 序列连接上述重、轻链，得到含信号肽及人 Ig 重链与轻链C 区基因得基因片段LigC( er+ Co tant）.然后与 Ne 与 me双酶切过得c A3 、1 CA 大片段连接，即得到嵌合抗体真核双表达载体pcDNA3 、 1C（ c i eric at b d ,CA).pcD A 、 1 图谱插入含鼠源Ig 重链与轻链V 区基因双酶切表达载体pcDNA3 、1-C 与纯化得VL ，经琼脂糖

11、凝胶电泳分离纯化目得片段后，连接、转化大肠杆菌，筛选出 pcDNA3 、1-CA-VL 阳性克隆 ,富集培养后提取质粒进行酶切鉴定。然后 ,双酶切表达载体 pcD 3、1-CA-VL 与纯化得 VH, 分离纯化相应得酶切片段，重复上述步骤，构建成重组表达载体 p NA 、 1 CA-X （抗原单词得首字母） 。3 转染S 2/0 细胞接种适量Sp2/0细胞于培养瓶中,培养12后用纯化得载体pcDNA 、 1-CA XXD ,采用Li f cami e 2000 试剂转染,按试剂盒使用说明书进行.设置空载体与无载体得细胞为对照。转染72 h后，加含MTX得选择性培养基进行筛选。2周后将生长出得阳

12、性克隆利用有限稀释法单克隆化.4 阳性克隆鉴定与筛选以间接法用抗原与酶标羊抗人gG c 片段抗体检测嵌合抗体得特异性及重组性。以适量抗原包被酶标板，加细胞培养上清反应后,再加羊抗人IgG F片段HR 酶标抗体（经鼠I吸附过）孵育,显色后测A490吸光值。5 抗体腹水生产腹腔种植转染瘤细胞，7 天后抽取腹水。一只种植杂交瘤细胞得小鼠有时可产生多达 1 l 得腹水。报道称从腹水中获得得嵌合抗体产量可达12m /m .七、时间及成本预算表 1时间预算项目时间 (周）载体构建 (外包，一次性）杂交瘤细胞培养、 5N 提取与反转录0、 5引物合成区基因扩增与克隆2V 区基因测序1插入表达载体及鉴定2表达载体扩增与抽提转染 Sp2 0 细胞与筛选嵌合抗体检测与筛选总计 (Fi st T me)20表 2成本预算项目费用 (元）感受态细胞 asy tor载体构建