TU-1901紫外可见分光光度计.ppt

1、1,TU-1901紫外可见分光光度计,检验与维护,2,一、紫外可见分光光度法,1、检测原理 紫外可见分光光度法是利用物质分子对紫外可见光谱区的辐射的吸收来进行分析的一种仪器分析方法。这种分子吸收光谱产生于价电子和分子轨道上的电子在电子能级间的跃迁，可用于定性分析，广泛应用于无机和有机物质的定量分析。,3,2、紫外可见分光光度法分类,比色分析法：利用比较待测溶液本身的颜色或加入试剂后呈现的颜色深浅来 测定溶液中待测物质的浓度的方法,按检测器不同分:目视比色法和光电比色法。,以人的眼睛来检测颜色深浅的方法称目视比色法； 以光电转换器为检测器来区别颜色深浅的方法称光电比色法；,根据物质对不同波长的单

2、色光的吸收程度不同而对物质进行定量分析的 方法称为分光光度法。,4,紫外可见分光光度法特点,灵敏度高，可用于测定试样中1%0.001%的微量组分，甚至可测定低至10-610-7的痕量成分； 准确度较高，测定的相对误差为2%5%，采用精密的分光光度计测量，相对误差可减少到1%2%； 分析速度快，操作简便； 价格低廉，应用广泛。,紫外可见分光光度法应用,紫外吸收光谱可用于芳香化合物及含共轭体系化合物的鉴定与结构分析 紫外与可见分光光度法均可用于定量分析。 紫外与可见分光光度法还可用于化学反应平衡的研究。,5,按波长范围划分： 可见分光光度计（400-780nm） 紫外可见分光光度计(200-100

3、0nm),紫外可见分光光度计类型,按光路划分： 单光束分光光度计 双光束分光光度计 双波长分光光度计,6,光的吸收程度与光程长的关系？,朗伯定律,7,比尔定律,光的吸收程度与浓度的关系？,8,2、朗伯比耳定律 朗伯比耳定律是光吸收的基本定律，是分光光度法定量分析的依据。 当入射光波长一定时，溶液的吸光度A是吸物质的浓度C及吸收介质厚度（吸收光程）的函数。其常用表达式为，式中为系数： A = C,9,二、紫外可见分光光度计,一、基本结构 光源、单色器、吸收池、检测器及信号指示系统五个结成部分。,10,分光光度计的主要部件和工作原理：,11,TU-1901单波长双光束分光光度计,12,（一）光源

4、紫外可见分光光度计理想的光源应具有整个紫外可见光域的连续辐射，强度应高，且随波长变化能量变化不大。在可见光区，常用钨丝灯（卤钨灯）为光源，波长范围为3202500nm。在紫外光区，常用氢灯、氘灯为光源，波长范围为200375nm。 TU-1901紫外可见分光光度计光源：卤钨灯与氘灯。 以下图片是该仪器的光源室及光源灯：,13,TU-1901光源室图片,光源室,聚光镜,14,TU-1901光源灯图片,钨灯,氘灯,15,（二）单色器 单色器是将光源发射的复合光分解为单色光的光学装置。 单色器一般由五部分组成：入光狭缝，准光器，色散器，投影器，出光狭缝。 色散器是单色器的核心部分，常用的色散元件是棱

5、镜和光栅。TU-1901采用全息光栅，进一步降低仪器的杂散光，使仪器分析更加准确。 单色器的狭缝设计一定的宽度，经过狭缝的单色光是一个具有一定光谱宽度的谱带，称为光谱带宽。从理论上讲，狭缝的宽度愈小，波长愈接近单色光，但带宽太小，将使单色光的强度减小，使光电流信号减弱，降低信噪比。,16,由于分子吸收光谱的吸收峰比较宽和平滑，一般情况下光谱带宽26nm对分析结果影响不大。TU-1901配置为固定狭缝，光谱带宽为2nm。,17,（三）吸收池 吸收池是盛放样品溶液的容器，它具有两个相互平行、透光且具有精确厚度的平面。,主要有石英吸收池和玻璃吸 收池两种。 在紫外区须采用石英吸收池， 可见区一般用玻

6、璃吸收池。,主要规格0.5cm、1.0cm、2.0cm、3.0cm和5.0cm,注意事项：使用比色皿时，手执比色皿两侧的毛面，严禁拿比色 皿的透光面，盛放液体不能超过容积四分之三高度。,18,（四）检测器 检测器是利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号。,常用的检测器有光电池、光电管及光电倍增管。,光电池 光电管 光电倍增管,TU-1810所用,19,三、分光光度计的检验和维护,（一）分光光度计的检验 为保证测试结果的准确可靠，新制造、使用中和修理后的分光光度计都应定期进行检定。单光束紫外-可见分光光度计的检定周期为1年，在此期间内，仪器经修理或对测量结果有怀疑时，应及时进行检定。,

7、20,紫外可见分光光度计主要检验的几项技术指标,1、稳定度 2、波长准确度 3、透射比准确度 4、基线平直度 5、噪声 6、吸收池配套性 现购买仪器因配置不定，检验技术指标参数有所不一，用户检验时用依据厂家提供的指标参数进行检验。,21,吸收池的配套方法,在同一光径的石英吸收池装蒸馏水在220nm、700nm处测定；玻璃池收池装30mg/L的重铬酸钾溶液在440nm处测定，装蒸馏水在700nm处测定。 实际工作中，可采用如下校准方法：在测定波长下，将吸收池磨砂面用铅笔编号，于干净的吸收池中装入测定用溶剂，以其中一个为参比，测定其它吸收池的吸光度，若测定的吸光度为零或两个吸收池的吸光度相等，即为

8、配对吸收池。若不能配对，可选出吸光度最小的吸收池为参比，测定其它吸收池的吸光度，求出修正值。,22,（二）TU-1901分光光度计测量条件的选择 1、测量波长的选择 通常都是选择最强吸收带的最大吸收波长max作为测量波长，称为最大吸收原则，以获得最高的分析灵敏度。 2、适宜吸光度范围的选择 任何光度计都有一定的测量误差，这是由于测量过程中光源的不稳定、读数的不准确或实验条件的偶然变动造成的。,23,一般来说，当透射比为15%65%（吸光度0.20.8)时,浓度测量的相对误差较小,当A=0.434时,浓度的相对误差最小。在实际工作中，可通过调节待测溶液的浓度或选用适当厚度的吸收池的方法，使测得的

9、吸光度落在所要求的范围内。 3、仪器狭缝宽度的选择 狭缝的宽度会直接影响到测定的灵敏度和校准曲线的线性范围。 狭缝宽度过大时，入射光的单色光降低，校准曲线偏离比耳定律，灵敏度降低；狭缝宽度过窄时，光强变弱，势必要提高仪器的增益，随之而来的是仪器噪声增大，于测量不利。,24,选择狭缝宽度的方法是：测量吸光度随狭缝宽度的变化。狭缝的宽度在一个范围内，吸光度是不变的，当狭缝宽度大到某一程度时，吸光度开始减小。因此，在不减小吸光度时的最大狭缝宽度，即是所欲选取的合适的狭缝宽度。,25,（三）分光光度计的保养和维护,分光光度计是精密光学仪器，正确安装、使用和保养对保持仪器良好的性能和保证测试的准确度有重

10、要作用。 1、对仪器工作环境的要求： （1）仪器应安放在干燥的房间内，使用温度为1535，相对湿度不超过80%。 （2）仪器应放置在坚固的平稳的工作台上，且避免强烈的震动或持续的震动。 （3）室内照明不宜太强，且应避免直射日光的照射。,26,（4）电扇不宜直接向仪器吹风，以防止光源灯因发光不稳定而影响仪器的正常使用。 （5）尽量远离高强度的磁场、电场及发生高频波的电器设备。 （6）供给仪器的电压AC220V10%，频率50HZ1HZ单向交流电，最好配置交流稳压器，功率不小于500VA,室内应有地线并保证仪器良好接地。 （7）避免在有硫化氢等腐蚀性气体的场所使用。,27,2、仪器保养和维护方法

11、（1）光源 光源的寿命是有限的，为了延长光源使用寿命，在不使用仪器时不要开光源灯，应尽量减少开关次数。在短时间的工作间隔内可以不关灯。刚关闭的光源灯不能立即重新开启。 仪器连续使用时间不应超过3h。若需长时间使用，最好间歇30min。 如果光源灯亮度明显减弱或不稳定，应及时更换新灯。更换后要调节好灯丝位置，不要用手直接接触窗口或灯泡，避免油污沾附。若不小心接触过，要用无水乙醇擦试。,28,TU-1901分光光度计对光源的使用要求：,1、分光光度计安装调试正常后，如无特殊情况不能随意搬动仪器机体，避免带来的震动引起光源灯及聚光镜等螺丝松动，导致光斑偏离。 2、正常情况下严禁分析人员打开光源室顶盖

12、，避免灰尘及其他物质进入影响聚光镜面。 3、仪器开机在自检过程中如提示钨灯或氘灯检测错误，联机使用时工作站初始化可能提示钨灯强度弱等现象，可关机后两分钟重新启动，若仍是此现象报告相关技术人员等待处理或直接联系厂家工程师到现场处理。,29,4、该仪器配备的氘灯属日本进口，使用寿命在5000小时左右，因现有检测项目使用光源均来自钨灯光源，为延长氘灯的使用期限，请在仪器开机自检完成后进入系统应用将其关闭。,30,5、如光源灯需要更换，请技术人员按照说明书上光源的更换方法进行更换。 （2）单色器 单色器是仪器的核心部分，装在密封盒内，不能拆开。选择波长应平衡地转动不可用力过猛。为防止色散元件受潮生霉，

13、必须定期更换单色器盒干燥剂（硅胶）。若发现干燥剂变色，应立即更换。 （3）吸收池 必须正确使用吸收池，在使用后应立即洗净应特别注意保护吸收池的两个光学面。生物样品、胶体或其它在池窗上形成薄膜的物质要用适当的溶剂洗涤。有色物质污染，可用3mol/LHCl和等体积乙醇的混合液洗涤。,31,（4）检测器 光电转换元件不能长时间曝光，且应避免强光照射或受潮积尘。 （5）当仪器停止工作时，必须切断电源。 （6）为了避免仪器积灰和玷污，在停止工作时，应盖上防尘罩，可在样品室及光源室内放置硅胶袋防潮，但开机时一定要取出。 （7）仪器若暂时不用要定期通电，每次不少于2030min，以保持整机呈干燥状态，并且维

14、持电子元器件的性能。 （8）每次使用后应检查样品室是否积存有溢出溶液，经常擦试样品室，以防废液对部件或光路系统的腐蚀。,32,（9）定期进行性能指标检测，发现问题即与厂家或销售部门联系解决。,33,(四)TU-1901紫外可见分光光度计的故障诊断与维修,34,35,四、可见分光光度法,分光光度分析有两种，一种是利用物质本身对紫外及可见光的吸收进行测定，另一种是生成有色化合物即“显色”以后测定。,36,（一）显色反应,在光度分析中，将试样中被测组分转变成有色化合物的反应叫显色反应。 能与被测组分生成有色物质的试剂称为显色剂。 显色反应分为两类：络合反应和氧化还原反应。其中络合反应是最主要的显色反

15、应。,37,对显色反应的要求： （1）选择性好 （2）灵敏度高 （3）有色络合物的离解常数要小 （4）有色络合物的组成要恒定，化学性质要稳定。 （5）如果显色剂有颜色，则要求有色化合物与显色剂之间的颜色差别要大，以减小试剂空白。 （6）显色反应的条件要易于控制。,38,（二）、显色剂,（1）、无机显色剂 许多无机试剂能与金属离子发生显色反应用于光度分析，但由于灵敏度等原因，具有实用价值的仅有几类。 （2）有机显色剂 大多数有机显色剂本身为有色化合物，与金属离子反应生成的化合物一般是稳定的螯合物。显色反应的选择性和灵敏度都较高，有些有色螯合物易溶于有机溶剂，可进行萃取光度法。,39,质检中心分析

16、中所用显色剂：,（1）水中铁含量的测定 邻菲啰啉 （2）磷酸盐的测定 钼酸铵,40,（三）反应条件的选择,1、显色剂用量 为使显色反应更完全，加入过量的显色剂是必要的，但是显色剂过量太多，有时会引起副反应，当显色剂本身有色时会增大试剂空白。 显色剂的适宜用量可通过实验来确定。其方法是固定被测组分浓度和其它条件，取数份溶液，加入不同量的显色剂测定其吸光度，绘制吸度光度（A）-浓度（c）关系曲线，一般可得下图所示三种情况。,41,cR,A,A,A,0,0,0,cR,cR,a,b,b,a,图示 吸光度与显色剂浓度的关系曲线,（a）,（b）,（c）,42,上图（a）曲线表明，在浓度ab范围内，吸光度出

17、现稳定值，可在ab间选择合适的显色剂用量。图（b）曲线表明，显色剂浓度在a b这一较窄的范围内，吸光度值比较稳定，必须严格控制显色剂浓度。图（c）曲线表明，随着显色剂浓度增大，吸光度不断增大，必须十分严格地控制显色剂用量。,43,2、溶液酸度,溶液的酸度对光度测定有显著影响，它影响待测组分的吸收光谱、显色剂的形态、待测组分的化合状态及显色化合物的组成。 第一，酸度不同时，显色化合物的组成和颜色可能不同。 第二，溶液酸度变化，显色剂的颜色可能发生变化，原因是很多有机显色剂是酸碱指标剂，其颜色随pH值变化而变化。 第三，溶液酸度过高会降低配合物稳定性，特别是对弱酸型有机显色剂和金属离子形成的配合物

18、影响较大。 第四，溶液酸度过低会引起金属离子水解生成氢氧化物沉淀。 由于酸度对显色反应的影响很大，因此，某一显色反应最适宜的酸度必须通过实验来确定。其方法是通过实验做吸光度A-pH关系曲线，选择曲线平坦部分对应的pH值作为应该控制的酸度范围。,44,3、温度的影响,大多数的显色反应在室温下即可进行，有些显色反应加热至一定的温度才能完成，而有些有色配合物在较高温度下容易分解，因此，对不同的显色反应应通过实验选择其适宜的显色温度。 由于温度对光的吸收及颜色的深浅都有影响，因此在绘制标准曲线和进行样品测定时，应使温度保持一致。,45,4、显色时间,所谓显色时间指的是溶液颜色达到稳定时的时间。不少显色

19、反应需要一定时间才能完成，而且形成的有色配合物的稳定性也不一样。因此必须在显色后一定的时间内进行比色测定。通常有以下几种情况： 加入显色剂后，有色配合物立即生成，并且生成的有色配合物很稳定。此时可在显色后较长时间内进行测定。 加入显色剂后，有色配合物的形成需要一定时间，但生成的有色配合物也很稳定。对这类反应可在完成显色后旋转一些时间内进行测定。 加入显色剂后，有色溶液立即生成，但在放置后又逐渐褪色，对这类反应，应在显色后立即进行测定。 适宜的显色时间和有色溶液的稳定程度可以通过实验来确定。方法是配制一份显色溶液，从加入显色剂起计算时间，每隔几分钟、几十分钟或数小时测定一次吸光度，绘制吸光度A-

20、时间t曲线，从曲线确定适宜的显色时间。,46,5、溶剂,有机溶剂常降低有色化合物的离解度从而提高显色反应的灵敏度。此外，有机溶剂还可能提高显色反应的速度，影响有色配合物的溶解度和组成等。利用有色化合物在有机溶剂中稳定性好，溶解度大的特点，可以选择合适的有机溶剂，采用萃取光度法来提高方法的灵敏度和选择性。,47,（三）参比溶液的选择,用参比溶液调节分光光度计的吸光度为0，然后测定试样溶液或标准溶液的吸光度值。参比溶液的作用除了消除吸收池壁对入射光的反射和散射等影响外，合理选用时还可消除其它干扰，使测得的吸光度正确反映被测物的浓度，提高测定的准确度。 选择参比溶液可分为以下几种情况：,48,溶剂参

21、比 显色剂及其它试剂均无色，被测溶液中又无其它有色离子时，可用溶剂（如蒸馏水或其它有机溶剂）作参比溶液。 试剂参比 显色剂本身有颜色，可用不加试样的其它试剂作参比溶液。 试液参比 显色剂无色，被测溶液中有其它有色离子，可采用不加显色剂的被测溶液作参比溶液。 其它参比 当显色剂有色，试液中的有色成分干扰测定的可在一份试液中加入适当的掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，然后加入显色剂和其它试剂，以此作为参比溶液。另一种方法是用不含被测组分的试样，与被测试样同时进行相同的处理得到平行操作参比溶液。,49,（四）定量分析,工作曲线法 对于单一组分的测定，工作曲线是实际工作中用得最多的一种定量方法。 工作曲线的

22、制作方法为：根据待测溶液的大概浓度，配制一系列浓度不等的标准溶液，使其浓度范围覆盖待测溶液的浓度，以空白溶液为参比溶液，在选定的波长下，分别测定吸光度。以标准溶液浓度为横从标，吸光度为纵坐标，绘制工作曲线。 在测定样品时按同样方法制备待测样品溶液，测定其吸光度，在工作曲线上即可查出待测物的浓度。待测物浓度应在工作曲线范围内（且使待测溶液浓度在曲线范围中部最佳）。 杂质用标准溶液浓度0.1g/L可在1525温度下保存2个月， 浓度0.1g/L的杂质用标准溶液需现配现用。,50,在一定条件下，工作曲线是一条直线，直线的斜率和截距可以用最小二乘法求得。 工作曲线可以用一元线性方程表示： y = a

23、b 式中，为标准溶液的浓度， y为相应的吸光度。 使用最小二乘法确定的直线称为回归线，a、b称为回归系数。 b是直线的斜率 a是直线的截距,51,图示 工作曲线,=510nm,可以用相关系数来表示线性关系的好坏。 相关系数越接近于1线性关系越好。一般的光度方法r0.999,工作曲线应定期校准。当条件有变动时，例如仪器经过修理、更换光源、更换标准溶液、试剂（如显色剂）重新配，都应重新制作工作曲线。 质检产品分析的所有比色工作曲线制作周期为一年，校验周期三个月。校验方法采用单点对照法：配制两组与所需校正的曲线相符合的标准溶液，在工作波长下测定其吸光度，利用该工作曲线计算出相应浓度，与配制的标准浓度

24、相比较，测得其回收率在95105%之间，说明该工作曲线可继续使用，如不符合需重新制作曲线。,52,（五）分光光度法的误差,1、方法误差 方法误差是指分光光度法本身所产生的误差。误差主要由溶液偏离比耳定律及溶液中干扰物质影响所引起。 （1）溶液偏离比耳定律 分光光度法的理论基础是朗伯-比耳定律 A=c b 但在工作中常会碰到工作曲线发生弯曲的现象。大多是由于化学变化所引起的，使有色溶液的浓度与被测物的总浓度不成正比。,53,（2）反应条件的改变 显色反应多是分步进行。溶液酸度、温度、及显色时间等反应条件的改变，都会引起有色配合物的组成发生变化，从而使溶液颜色的深浅度发生变化，因而产生误差。 2、仪器误差 仪器误差是指由使用分光光度计所引入的误差。 （1）仪器的非理想性引起的误差 复色光引起对比耳定律的偏离;波长标度尺未作校正时引起光谱测量的误差,吸光度测量受吸光度标度尺的误差影响。 （2）仪器噪声的影响 光度测定的准确度和精密度受仪器噪声的限制，测量样品的吸光度要经过测T=0%、T=100%、及样品的T三个步骤。三步噪声的总和即为T测量的总噪声，它由光源强度、电子元件、光电管等的噪声决定。 （3）反射和散身的影响 由