第八章DNA重组与转座.ppt

1、DNA重组与转座,概述,第一节 同源重组,第二节 位点专一性重组,第三节 转座作用,第四节 逆转录转座子,概述：, 只要有DNA，就会发生重组,减数分裂,高等Euk.体细胞核基因、叶绿体和线粒体,温和噬菌体,转座子转座, 生存变异突变，重组 损伤修复、适应环境、加速进化, 广义遗传重组：任何造成基因型变化的基因交流过程,DNA重组 DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合。 （1）同源重组 （2）位点特异性重组 （3）转座重组 （4）异常重组, DNA重组可分为四类（DNA序列、蛋白质因子）, 重组DNA技术,第一节 同源重组,1、 同源重组（homologous recombination

2、）: 发生在同源DNA序列之间,一、特征,2、 特征：, 涉及同源序列间的联会配对，且交换的片段较大, 涉及DNA分子在特定的交换位点发生断裂和错接的生化过程 异源双链区的生成, 存在重组热点, 需要重组酶, 单链DNA分子或单链DNA末端是交换发生的重要信号,细线期,合线期,粗线期,双线期,终变期, e.g. Euk.减数分裂时 的染色单体之间 的交换 细菌的转化， 转 导，接合，噬菌体 重组,双倍体染色体交换,二 同源重组的分子模型,1.Holliday于1964年提出Holliday模型 （1）两个同源染色体DNA排列整齐 （2）两DNA分子同一部位两单链发生断裂引发重组 （3）断裂的单

3、链游离末端彼此交换形成Holliday中间体 （4）通过分支迁移产生异源双链DNA分子。 （5）中间体在内切酶和连接酶作用下，形成拼接重组体和片段重组体。,Synapsed chromatids,Recombination joint,Heteroduplex DNA,片段重组体,拼接重组体,Holliday中间体,Meselson-Radding模型 单链入侵模型（链转移模型）,置换,侵入,Loop切除,同化 异构化 分支迁移,5,双链断裂修复模型,2、 分枝迁移和Holliday中间体结构的拆分, 分枝迁移（branch migaration） 双螺旋形成的交叉连接以拉链式效应扩散,Hol

4、liday的异构化,产生重组体的拆分,Holliday结构一经生成即可 不断地处于异构化异源双链 heteroduplex DNA,重组结果取决于拆分时 配对链上的切口位置,（1）,（2）,（1）,（2）, Holliday结构的拆分,产生含异源双链的片段重组体,产生拼接重组体,“亲本链-片段重组体”,“拼接重组体”,三、原核同源重组（E.coli）, 发生在双方DNA的同源区域,部分复制的染色体DNA之间或染色体DNA与外源DNA之间 细菌的转化、结合和转导,1、RecBCD酶和 Chi 位点, RecBCD酶具有ATP依赖的解旋酶活性、依赖于ATP的核酸外切酶活性、序列特异性的单链内切酶活

5、性., 单链内切酶活性和解旋酶活性使DNA产生具有游离末端的单链 RecA的作用位点, Chi位点含有GCTGGTGG序列,是基因recBCD编码RecBCD酶作用的靶位点, RecBCD的识别和切割位点,a、 RecBCD结合在DNA的平 头末端（产生机制不清楚）,b、 外切、解链、移动 （ATP）,c、 兔耳状 loop 结构产生 （再旋酶活性低于解旋酶活性）,d、 RecBCD 在 loop 单链区的 chi 位点3方46NT处切 断单链（单链内切酶）, chi位点：GCTGGTGG 目前发现的重组热点 E.coli 含 1000 个、Euk.,e、 RecBCD 切割产生3单链末端,2

6、、RecA 蛋白,（1） 活性,a、 RecA 有单、双链 DNA 结合活性,b、 RecA 有 NTPase 活性（底物差异活性） 与单链 DNA 结合时活性最大-依赖于 DNA,c、 RecA 有启动一个分子的单链侵入到另一双螺旋分子 的能力，即联会同源 DNA （但其靶 DNA 必须有缺口结合DNA）,RecA引发链侵入模型,RecA promotes the assimilation of invading single strands into duplex DNA so long as one of the reacting strands has a free end.,RecA

7、启动的单链入侵,RecA引起的链交换和Holliday结构的生成,（2）RecA 蛋白催化双链和单链 DNA 的反应阶段,a、 联会前阶段（缓慢） RecA 与单链结合,b、 单链与双螺旋的互补链迅速配对，形成双链连接分子 Holliday（5侵入）,c、 从双螺旋结构中缓慢置换一条链产生一段长的异源双链 DNA 反应结束时，RecA 结合到双链上, 其中单链同化有固定的方向 入侵单链为53 双链 DNA 的互补链是35, RecBCD 和 RecA 的共同作用,3、原核同源重组的其它蛋白,需要 E.coli 中三个基因 ruvA,ruvB 和 ruvC 的产物,a、 RuvA 识别 Holl

8、iday 结构的连接点,b、 RuvB 为分枝迁移提供动力（ATPase 1020bp/s）,c、 RuvC 核酸内切酶-专一性识别 Holliday 结构的连接点 体外切段连接点以拆分重组体, E.coli 重组的各阶段 （损伤修复）,损伤DNA复制产生缺口,RecA链交换,第二次链交换,DNApol通过DNA合成填满缺口,RuvA,B分枝迁移,RuvC切割Holliday连接点,第二节 位点专一性重组,一、位点专一性重组（ site-specific recombination）,1、概念：发生在专一序列的DNA分子间的重组,有特异的 重组酶和辅助因子对其识别和作用。,噬菌体基因组整合到细

9、菌染色体基因组中属此种重组,2、位点特异性重组的结果依赖于重组位点的位置和方向,二、phage的整合与切除,1、实现机制：,均是通过-细菌DNA和DNA上特定位点之间的重组,2、特定位点-附着位点（attachment site att）, E.coli attB 含BOB序列 23bp, phage attP 含 POP序列 240bp, 核心序列 “O区”完全一致 （同源部分15bp） -位点特异性重组发生的地方,3、整合过程, 整合后的附着位点为 attL（BOP） attR（POB）, 整合位点-attB、attP 切除位点-attL、attR, 整合过程需要整合酶 （integras

10、e Int）（编码） 和寄主的整合宿主因子IHF （integration host factor） 共同作用,溶源性细菌 (lysogen),溶菌周期 （lysis）,原噬菌体,4、整合分子机制, 核心序列O全长15bp，富含A-T, 发生在O内的重组交换位点相距 7bp, 整合酶的结合位点：attP 240bp、attB 23bp(两者的作用不同), attP位点的负超螺旋为重组所必须-加强了Int和IHF的亲和力 -高剂量的蛋白维持单链重组所必需的结构, Int结合 -核心序列的反向位点（切割位置） -结合在att臂上（臂与核心区靠近）,Xis, 整合体及其作用 整合体（intasome

11、）- Int和IHF结合到attP时的复合物, 整合体捕获attB 说明- a、attB和attP的最初识别靠Int 识别两序列的能力 b、两序列的同源性在链交换时为 重要因素, Int蛋白能切断DNA，并使它重新连接，近而使holliday结构拆分, 重组时attP和attB部位交叉断裂，互补单链末端进行交叉杂交,5、整合与切除的控制,（1） 整合, C-促使阻遏蛋白C的产生 -与int gene 的PI结合，转录产生Int蛋白 -且PI位于xis基因内，C与PI结合导致xis gene失活,（2） 切除, 寄主SOS反应时-RecA大量产生，促使阻遏蛋白C的水解 -把OL和OR从阻遏状态释

12、放出来 -从PL转录使int和xis表达,细菌的特异位点重组鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白H1和H2转换,四、依赖于同源重组的位点特异性的序列代换 -酵母MAT序列的转换,1、 酵母结合型的转变-DNA序列的代换，而不是互换 -依赖于序列的同源性 （被代换的序列命运是被降解-突变试验）,2、 同源序列,匣子 W X Y Z1 Z2 total HML 723 704 747 239 88 2501 MAT 723 704 747 239 88 2501 MATa 723 704 642 239 88 2369 HMRa 704 642 239 88 1585,3、 转换过程, 内切酶(HO)识别、切

13、割-Y/Z1交界处-起始MAT序列的转换 (双链断裂) HM匣子受Sir阻遏蛋白的保护, Y区域被降解，直到Y和Ya相同的部分或一直到X区域, 四个断头侵入供体匣子的同源部分并与其中互补链配对, 以供体DNA为模板复制Y区域，holliday结构形成, Holliday结构的拆分，产生新的MAT匣子和这次转换中的供体匣子,4、 特征-同源重组和位点特异性重组特征都具有, 需要大范围的同源序列, 需要重组酶系（rad52基因产物、位点特异性的HO内切酶）,第三节 转座作用,一、转座子概述,1、转座子(元)或转座元件(transposon or transposable element): 基因组

14、上不必借助于同源序列就可以移动的DNA片段，它们可以直 接从基因组的一个位点移到另一个位点（供体和受体）,转座（transposition）：转座子的转移过程,2、发现和发展, 1914 A. Emerson 1936 Marcus . M. Rhoabes 玉米果皮、糊粉层花斑突变,玉米籽粒糊粉层色素不稳定遗传机理,跳跃基因（jumping gene）, 1947 冷泉港实验室（美） Barbara McClintock, 基因转座现象的再次发现与证实,在一个操纵子中， 与操纵基因毗连的结构基因发生终止 突变后，它除了影响该基因本身产物的翻译外，还影响 其后结构基因多肽的翻译，并且具有极性梯

15、度的特征。,插入型极性突变的发现与机理,Operon & Polarity Mutation,20世纪60年代末期,在不同实验室发现一系列可转移的抗药性转座子 1983年Barbara McClintock被授予诺贝尔生理学与医学奖。,a) 不依赖供体序列与靶位点间序列的同源性,b) 转座不是简单的转移，涉及转座子的复制,Hotspots (热点) Regional preference ( 在3kb区域内的随机插入),d) 某些转座因子（Tn3）对同类转座因子的插入具有排他性 （免疫性）,e) 靶序列在转座因子两侧会形成正向重复,f) 转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应,3、转座重组

16、的特点,c) 转座插入的靶位点并非完全随机（插入专一型）,二、Prok.转座子种类, 两种类型： 简单转座子（simple transposon） （插入序列 insertion sequence IS ） 复合转座子（composite transposon）, 共同特征： a）两端有2040bp的IR b）具有编码转座酶（transposase）的基因,1、插入序列, 最简单，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分, 命名： IS编号（鉴定类型） 长度 7002000bp, 特点： a）两端IR为转座酶的识别位点（突变） b）插入靶位点后会出现靶位点的正向重复（39bp）, IS 可以正

17、反方向插入到DNA（宿主、质粒或某些噬菌体）， 常对插入位点后面的基因表达功能产生极性效应,a) Tn / TnA family,l 具有IR、转座酶基因、 调节基因（解离酶）、抗抗生素基因,l Tn1 (AmpR) Tn2 (AmpR) Tn3 (AmpR) Tn4 (AmpR StrR) Tn5 (KanR) Tn6 (kanR) Tn7 (StrR TmpR) Tn9 (CamR) Tn10 (TetR),2、复合转座子, 两种类型,b）两端重复序列为IS的复合转座子,e.g. IS插入到功能基因两端，可能形成复合转座因子,transposition, 当两个IS组件相同时，其中任一个都

18、可行使转座功能, 不同时，主要依靠一个, 两侧的IS既可以是IR，又可以是DR状态 （IR多）,3 转座噬菌体 Mu phage （巨型转座子 ）,C repressor for A, B B 33 kd 与转座有关 A 70 kd 转座酶 U, S 毒性蛋白 attL, attR 与寄主同源，反向重复，转座必需 Gin G区倒位酶, 以E.coli为寄主的温和型噬菌体（溶源、裂解）, Mu的插入途径,a） 侵入的Mu在溶源化过程中任意插入寄主DNA （两侧各5bp的靶位点序列重复）,b） 进入裂解生长后，复制产生后代Mu DNA几乎全部插入寄主 DNA中，并可继续转座（形成寄主DNA和Mu的

19、共合体），噬 菌体成熟时，切段共合体包装,三、转座子的转作机制及模式, 三种类型：复制型、非复制型和保守型,1、复制型转座模式, 实质：转座子元件被复制并被移动到受体位点，最终转座过程 扩增了转座子的拷贝（供、受点）, 需两种酶： 转作酶（作用于原拷贝两末端） 解离酶（作用于复制后的拷贝）, 模式：, 两大步,a) 共合体形成 切口连接复制,b) 拆分,靶位点的DR形成,2、非复制型转座模式, 供体上最终产生双链断裂, 供体位点如不能被修复则有致 死效应,3、保守型转座模式, 另一种非复制型, 与整合机制相似 其转座酶与整合酶家 族有关,4、TnA转座模式, 复制型转座 转座酶(tnpA)、

20、解离酶(tnpR), 解离酶需要特异的内 部位点 双重功能：解离功能 tnpA及自身的阻遏物, 拆分位点 res 共合体拆分位点, 转座结果产生5bp 的正向重复序列,四、转座子转座频率的调控, 每个转座子控制自身转座的核心-控制转座酶的水平,1、Tn10转座机制, Tn10为复合型转座子, IS10R元件提供转座酶活性-合成转座酶的序列, 自发转座频率-107, Tn10转座酶水平是控制转座的关键, 有两种控制转座的方式,a） 通过反义RNA的翻译水平控制, IS10R外侧边缘两个启动子, PIN控制IS10R的转录 弱启动子, POUT强启动子 右向转录宿主DNA, INRNA和OUTRN

21、A 有36bp的重叠 稳定性： OUTRNAINRNA, 大量OUTRNA作为 INRNA的反义RNA,b） 甲基化作用控制转座酶合成及其与DNA的结合, Tn10转座酶启动子含有GATC序列（其它转座子）, E.coli中Dam甲基化酶 作用使启动子相对钝化 只能利用刚刚复制完成 时出现少数转座酶, 此外，IS10R的末端 IR也含有GATC， 甲基化的GATC不能 结合转座酶, Tn10在DNA刚刚 复制后发生转座,五、转座子的某些遗传学效应,1.转座频率10-810-3，引起插入突变； 2.插入位置染色体重排而出现新基因； 3.影响插入位置邻近基因的表达,使宿主表现型改变； 4.引起染色体插入位点两侧染色体畸变。,真核生物的转座成分根据转座机制目前分为两类：,a) 转座机制与细菌的转座子类似 遗传信息： DNADNA, 玉米的Ac-Ds元件、果蝇的P元件和FB元件等,b) 转作机