分子生物课件

1、经典的基因概念：三位一体基因：突变的最小单位 重组的最小单位 功能的最小单位现代的基因概念： 1基因具有精细结构： 重组子（recon）突变子（muton）顺反子（cistron）2基因序列的多样性：跳跃基因 断裂基因 重复序列 假基因突变子：突变单位，基因内部有许多突变位点，也称突变子（muton）即突变后产生变异的最小单位。重组子：重组单位，基因内部有多个重组单位，也称重组子（recon）不能由重组分开的最小单位。顺反子（cistron，又叫作用子）：功能单位，从功能单位的意义上讲，一个顺反子相当于一个基因的DNA或RNA单元，它的产物是一个完整的肽链或者RNA分子，平均大小约为500-1

2、500bp。断裂基因(split gene)：指基因内部被一个或更多不翻译的编码顺序即内含子所隔裂。1977年美国的Sharp和Roberts两组科学家分别同时发现。内含子(intron)：在成熟mRNA的片段中未反应出的DNA区段(ABCDEFG) 非编码序列外显子(extron/exon):DNA序列中被转录成为mRNA中的片段()编码序列重叠基因(overlapping gene)：两个或两个以上的基因共有一段DNA序列的现象重复序列：是指在一个DNA分子中出现不止一次的序列，重复序列可彼此相同方向（正向重复）也可以相反方向（反向重复）根据重复程度，可以将DNA序列分为三种类型：单一或轻

3、度重复序列：基因组中只有一个拷贝或重复频率很低的序列；中等重复序列：重复次数几十次到几百次的序列；高度重复序列：重复次数几百次到几百万次的序列跳跃基因：是一类反转座子( retrotransposon)，即通过RNA中间产物在天然状态下由基因组中一个位点进行复制，插入到基因组其它位点从而整合到基因组中的DNA序列。跳跃基因可引起基因组发生大范围基因重排。假基因（pseudogene）：在多基因家族，核苷酸组成序列上与有功能的基因非常相似，但不具正常功能的基因根据基因的转录和翻译功能可以把基因分为三类第一类是编码蛋白质的基因，它具有转录和翻译功能，包括编码酶和结构蛋白的结构基因以及编码阻遏蛋白的

4、调节基因第二类是只有转录功能而没有翻译功能的基因，包括tRNA基因和rRNA基因第三类是不转录的基因，它对基因表达起调节控制作用，包括启动基因和操纵基因基因组细胞内遗传信息的携带者DNA的总体细胞核（chromosome DNA）细胞质（mitochondrion DNA）基因组中不同的区域具有不同的功能有些区域编码蛋白质的结构基因有些区域复制及转录的调控信号有些区域的功能尚不清楚病毒的结构和功能病毒不能独立地复制，必需进入宿主细胞中，借助细胞内的一些酶类和细胞器才能使病毒得以复制外壳蛋白（或被膜）的功能是1识别和侵袭特定的宿主细胞2保护病毒基因组不受核酸酶的破坏 病毒基因组的结构特点1.病毒

5、基因组大小相差较大，与细菌或真核细胞相比，病毒的基因组很小2. 病毒基因组只有一种核酸组成：DNA或RNA3. 多数RNA病毒的基因组是由连续的4. 基因重叠，即同一段DNA片段能够编码两种甚至三种蛋白质分子5. 基因组的大部分可编码蛋白质，只有非常小的一部份不编码蛋白质（通常是基因表达的控制序列）6. 形成多顺反子结构（polycistronie7. 除了反转录病毒以外，一切病毒基因组都是单倍体，每个基因在病毒颗粒中只出现一次8. 噬菌体（细菌病毒）的基因是连续的，而真核细胞病毒的基因是不连续的乳头瘤病毒（papillomavirus）是感染人和动物皮肤粘膜并引起乳头状瘤病变的一种DNA病毒

6、属于乳多空泡病毒（papovavirus）科根据病毒感染的宿主不同可以分为牛乳头瘤病毒（BPV）人乳头瘤病毒（HPV）乙肝病毒基因组的结构和功能（一）乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）是目前已知的感染人类的最小的双链DNA病毒HBV的基因组结构显得特别精密浓缩，基因组DNA结构奇特环状的部分双螺旋结构，长约3.2kb。其中的2/3为双螺旋结构，1/3为单链，DNA中的两条链不等长长链为负链，5端与3端无共价连接，而是与一种蛋白质共价相连短链为正链，长度视病毒而异，一般长约1.6-2.8kb,约为长链的2/3，短链之间的空隙可由病毒颗粒中的DNA聚合酶充填1. 重叠的基因序列

7、比较多已确定的开放读码框架（open read frame，ORF）有4个，分别编码：病毒的核壳（C） 包膜（S）蛋白病毒复制酶（聚合酶) 与病毒基因表达有关的蛋白质（X）2. 调节序列位于基因内部启动子存在于编码蛋白质序列内增强子（enhancer）位于聚合酶基因中polyA附加信号位于CORF中皮质激素敏感因子（GRE）位于SORF和聚合酶基因中HBV DNA复制过程1.以“-”链DNA 为模板合成全长的“+”链RNA（称为前基因组RNA）（亲代“-”链DNA “+”链RNA）2.该“+”链RNA被包装在未成熟的核心样颗粒中，同时还有DNA 聚合酶和一种蛋白质也被包装在颗粒中（“+”链RN

8、A等包装成病毒核心颗粒）3.在该颗粒中，再以“+”链RNA 为模板由反转录酶催化合成“-”链DNA（“+”链RNA子代“-”链DNA）4.“+”链DNA的合成便以该“-”链DNA为模板和一段RNA为引物而聚合延伸，核心样病毒颗粒成为成熟的病毒颗粒。这时，“+”链DNA还没有合成完毕，因而造成病毒基因组两条DNA链长度不一样（子代“-”链DNA 子代“+”链DNA）细菌染色体基因组结构1. 形成类核（nucleoid）由一条环状双链DNA 分子组成细菌的染色体，并相对聚集在一起，形成一个较为致密的区域类核无核膜与胞浆分开，类核的中央部分由RNA和支架蛋白组成，外围是双链闭环的DNA超螺旋2. 染

9、色体DNA通常与细胞膜相连连接点的数量随细菌生长状况和不同的生活周期而异在DNA链上，与DNA复制、转录有关的信号区域与细胞膜优先结合3操纵子结构结构基因为多顺反子，若干个功能相关的结构基因串联在一起，受同一个调节区的调节数个操纵子还可以由一个共同的调节基因（regulatorygene）即调节子（regulon）所调控4.结构基因都是单拷贝，rRNA基因为多拷贝基因组DNA中不编码的部份所占比例比真核细胞基因组少得多原核生物终止子有强、弱之分强终止子：含有反向重复顺序，可形成茎环结构，其后面为polyT结构，无需终止蛋白参与即可使转录终止弱终止子：也有反向重复序列，但无polyT结构，需要有

10、终止蛋白参与才能使转录终止DNA分子组成operon）结构rRNA基因是多拷贝isogene). DNA序列，包括插入序列和转座子DNA分子中具有多种功能的识别区域大肠杆菌染色体基因组的结构和功能1大肠杆菌基因组含有3500个基因，已被定位的有900个左右900个基因中，有260个基因已查明具有操纵子结构，定位于75个操纵子中已知的基因中，8 的序列具有调控作用大肠杆菌染色体基因组中已知的基因多是编码酶类的基因合成代谢酶类基因：氨基酸、嘌呤、嘧啶、脂肪酸维生素分解代谢酶类基因：碳、氮化合物具有相关功能的基因在一个操纵子内，由一个启动子转录大多数基因的相对位置是随机分布的双向转录：DNA两条链作

11、为模板指导mRNA合成的机率差不多相等在已知转录方向的50个操纵子中，27个操纵子按顺时针方向转录，23个操纵子按反时针方向转录在大肠杆菌染色体基因组中，基因都是单拷贝基因在某种特殊环境下，需要有多拷贝基因来编码大量的基因产物基因组上的各个基因的位置与其功能的重要性可能有一定的联系 ProkaryoteGenome1、常仅由一条环状双链 2、只有一个复制起始点 3、具有操纵子结构 4、编码顺序一般不会重叠5、基因是连续的，无内含子，转录后不需剪接6、编码区在基因组中所占比例大于真核基因组，小于病毒基因组7、基因组中重复序列少，一般为单拷贝，8、具有编码同工酶的基因 9、基因组中存在可移动的DN

12、A序列，包括插入序列和转座子 10、在DNA分子中具有多种功能的识别区域真核生物基因组特点1. 基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内，除配子细胞外，体细胞内基因组是双份的（即双倍体，diploid），有两份同源的基因组2. 基因转录产物为单顺反子。一个结构基因经过转录生成一个mRNA分子，再翻译生成一条多肽链3. 存在重复序列，重复次数可达百万次以上4. 基因组中不编码的区域多于编码的区域5. 大部分基因含有内含子，因此，基因是不连续的（断裂基因，split gene）6. 基因组远远大于原核生物的基因组，具有许多复制起始点，而每个复制子的长度较小高度重复序列high repea

13、ted sequence在基因组中所占比例随种属而异，约占10-60，在人基因组中约占20 。高度重复顺序又按其结构特点分为三种种类1反向重复序列2卫星DNA3较复杂的重复单位组成的重复顺序高度重复顺序的功能1. 调节反向序列常存在于DNA复制起点区的附近。另外，许多反向重复序列是一些蛋白质（包括酶）与DNA的结合位点2. 参与基因表达的调控DNA的重复顺序可以转录到核内不均一RNA（hnRNA）分子中，并形成发夹结构，这对稳定RNA分子，免遭分解有重要作用3. 参与转位作用：几乎所有转位因子的末端都包括反向重复顺序，长度由几个bp到1400bp。由于这种顺序可以形成回文结构，因此在转位作用中

14、既能连接非同源的基因，又可以被参与转位的特异酶所识别4.与进化有关：不同种属的高度重复顺序的核苷酸序列不同，具有种属特异性，但相近种属又有相似性。如：人与非洲绿猴的卫星DNA长度仅差1个碱基（前者为171 bp，后者为172bp），而且碱基序列有65是相同的，这表明它们来自共同的祖先5. 同一种属中不同个体的高度重复顺序的重复次数不一样，这可以作为每一个体的特征，即DNA指纹6. 卫星DNA 成簇的分布在染色体着丝粒附近，可能与减数分裂时染色体配对有关，即同源染色体之间的联会可能依赖于具有染色体专一性的特定卫星DNA顺序中度重复序列middle repeated sequence重复数十至数万

15、（10kb 由5-8bp富含G的串联重复序列即富G链和其互补链富C链组成四膜虫：5TTGGGG3 人类：5TTAGGG 315kb 端粒结合蛋白 :保护端粒DNA，免被修饰和核酸酶作用。人类：称为端粒重复序列结合因子（telomeric repeats binding factor TRF)人的端粒DNA,序列长约515kb序列：（TTAGGG）n ，串联重复端粒结合蛋白 （TRF）端粒酶是端粒复制所必须的一种特殊的DNA聚合酶。具有逆转录酶活性能以hTR为模板，向染色体末端添加TTAGGG序列结构端粒酶RNA：含与TEL互补的模板RNA序列端粒酶蛋白：应具有逆转录酶活性，对其结构和功能端粒酶

16、功能 以自身RNA为模板，逆转录合成和补充端粒DNA重复序列 所需物： 模板：端粒酶RNA 逆转录酶：端粒酶蛋白 原料：dNTP 引物：TEL 3端。体外TEL类似序列也 能作为引物，是端粒酶测定的基础。 细胞内端粒酶活性的缺失，导致：端粒缩短端粒一旦缩短到短于某个“关键长度”，就很有可能导致：染色体双链断裂，并激活细胞自身的检验系统，使细胞进入M1期死亡状态随着端粒的进一步丢失，发生染色体重排，导致：无着丝粒染色体和非整倍体染色体的形成等，使细胞进入M2期死亡状态如果细胞要维持其正常分裂，就必须激活端粒酶，阻止端粒的进一步丢失否则，细胞不能进行染色体的正常复制只有重新获得端粒酶活性的细胞，才

17、能继续生存下去无法激活端粒酶的细胞（即无法阻止端粒进一步丢失），只能面临趋向衰老抑制端粒酶活性为靶点的肿瘤 治疗研究 主要策略有： 阻断端粒酶RNA的模板作用抑制端粒酶催化蛋白亚基核苷类似物竞争性抑制反转录过程细胞分化诱导剂抑制端粒酶活性对细胞内调节机制进行调控其它抑制剂对端粒酶活性的调节抑制端粒酶活性 阻断端粒酶RNARNA的模板作用端粒酶是以其自身RNA为模板来合成端粒DNA序列，因此可以通过消除其模板作用抑制端粒酶活性，达到限制端粒合成的目的消除端粒自身模板作用的方法反义核苷酸封闭hTR反义肽核酸封闭hTR锤头状核酶切割hTR序列反义核苷酸封闭 hTRhTR端粒酶RNA序列中含有与端粒D

18、NA互补的模板序列，因此可设计能与之结合的反义核苷酸来灭活端粒酶，从而阻止端粒序列的合成反义肽核酸封闭 hTRhTR肽核酸（peptide nucleic acids,PNA）是一类人工合成的DNA或RNA类似分子PNA与核酸分子的不同之处在于：将DNA中的磷酸脱氧核糖骨架被酰胺键连接的多肽骨架所代替，碱基通过亚甲羧基链与骨架中甘氨酸的氨基连接PNA具有与天然DNA相类似的结构特征和相同的DNA/RNA结合特性锤头状核酶切割 hTRhTR序列核酶是一类具有酶活性的小分子RNA，通过序列特异性地与靶RNA分子配对，对底物进行切割，从而使其失去生物学功能目前关于端粒及端粒酶的研究主要集 中在以下几

19、个方面 a.端粒酶的结构和功能.b.端粒酶的纯化和激活机制.c.寻找端粒酶的专一性抑制剂及其在抗癌中的应用.d.端粒的高级结构及结合蛋白的作用机理.肿瘤发生的端粒-端粒酶学说端粒每次分裂，端粒缩短缩短至某已特定长度，一发生P53、Rb等基因突变细胞继续分裂，少数端粒酶激活；其中有的染色体不稳定，出现融合M2期细胞，细胞永生化无限增殖给另外基因损伤的积累提供机会肿瘤二M1期细胞，死亡信号转导：胞外信号分子(可溶性分子、细胞表面分子、组织基质分子)靶细胞跨膜分子(如GPCR、EGFR等)靶细胞受体（胞内段）化学变化（如磷酸化、二聚体形成）靶细胞内信号转导分子化学变化与激活（如磷酸化、去磷酸化、聚体

20、形成）激活的信号转导分子进入胞核进入胞核的转导分子作用于基因转录调控区，导致基因表达改变第一信使：由细胞分泌的调节靶细胞生命活动的化学物质的统称。（激素、细胞因子、气体等）第二信使(secondary messenger) 在细胞内传递信息的小分子物质，如：Ca2+、DAG、IP3、Cer、cAMP、cGMP、花生四烯酸及其代谢产物等。第三信使(third messenger) 负责细胞核内外信息传递的物质，又称为DNA结合蛋白，是一类可与靶基因特异序列结合的核蛋白，能调节基因的转录。如立早基因(immediate-early gene)的编码蛋白质。受体的定义:是靶细胞膜上或细胞内能特别识别

21、生物活性分子(信号分子)并与之结合的成分，它能把识别和接受的信号正确无误地放大并传递到细胞内部，进而引起生物学效应的特殊蛋白质，个别是糖脂。能与受体呈特异性结合的生物活性分子则称配体(ligand)。受体的分类、一般结构与功能存在于细胞质膜上的受体，绝大部分是镶嵌糖蛋白。根据其结构和转换信号的方式又分为三大类：离子通道受体，GG蛋白偶联受体(G protein Coupled Receptor , GPCR)和单跨膜受体(催化性受体)。（一）膜受体(membrane receptor)（二）胞内受体(intracellular receptor)位于细胞浆和细胞核中的受体，全部为DNA结合蛋白

22、1.离子通道受体受神经递质等信息物质调节。当神经递质与他们结合后，可使细胞膜上的离子通道打开或关闭，从而改变膜的通透性。2. Definition for G-protein-coupled receptors,GPCR G蛋白偶联受体家族3. 单个跨膜螺旋受体含TPK结构域的受体EGF:表皮生长因子 IGF-1:胰岛素样生长因子PDGF:血小板衍生生长因子 FGF:成纤维细胞生长因子(催化性受体) 蛋白质二聚作用1. 相互作用的分子拉近；2. 能使底物与酶的活性位点以更适合催化作用的方位相互楔合大大增加了反应速度。这种定向作用对信号转导的突出意义G蛋白(guanylatebinding pr

23、otein)GTP-结合蛋白1.三聚体G蛋白,与膜受体偶联,位于细胞膜胞浆面的外周蛋白2.结构：三种亚基固定于细胞膜内侧 3.特性：具GTP酶的活性一、膜受体介导的信息传递cAMP-蛋白激酶途径组成：胞外信息分子，受体，G蛋白，腺苷酸环化酶(adenylatecyclase，AC)，cAMP，蛋白激酶A(protein kinaseA，PKA)Ca2+-依赖性蛋白激酶途径1. Ca2+磷脂依赖性蛋白激酶途径2. Ca2+钙调蛋白依赖性蛋白激酶途径( Ca2+CaM激酶途径)cGMP-蛋白激酶途径受体鸟苷酸环化酶转导系统 特点：受体具GC活性无需G蛋白介导组成酪氨酸蛋白激酶途径酪氨酸蛋白激酶(t

24、yrosine protein kinase, TPK)分类受体型TPK（位于细胞质膜上）如胰岛素受体、生长因子受体等非受体型TPK（位于胞浆）如JAKSTAT途径核因子途径核因子B (nuclear factor-B, NF-B)TNFCer等激酶系统病毒感染、脂多糖、活性氧中间体、佛波酯、双链RNA等PKA、PKC等激活NF-BTGF-途径二、胞内受体介导的信息传递胞内受体核内受体胞浆内受体配体类固醇激素甲状腺激素信号转导的研究方法与工具一、蛋白质磷酸化状态的检测1、免疫印迹(phospho-protein specific antibodies)2、免疫沉淀(protein-specif

25、ic antibody + phospho-AA antibody3、流式细胞仪分析二、信号转导分子过度表达或过度激活1、Overexpressionby gene transduction2、Constitutively activated mutants三、基因转录活性测定1、Electrophoreticmobility shift analysis (EMSA)、Reporter gene expression detection四、信号转导分子的表达或活性抑制1、Anti-sense 2、RNAi3、Gene knock-out 4、Dominant negative mutants

26、5、Small-molecule inhibitors 6、Inhibitory oligopeptides基因工程(Genetic Engineering)的基本定义(狭义)原称遗传过程（Genetic EngineeringGenetic Engineering）从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状供体、受体和载体称为基因工程的三大要素，其中相对于受体而言，来自供体的基因属于外源基因除了少数RNA病毒外，几乎所有的基因都存在于DNA结构中，而用于外源基因重组拼接的载体也都是D

27、NA分子，因此基因工程也称为重组DNA技术（DNA Recombination）基因工程的基本定义(广义)为DNA重组技术的产业化设计与应用包括上游技术和下游技术上游技术指的是外源基因重组、克隆和表达的设计与构建（即狭义的基因工程）下游技术则涉及到含有重组外源基因的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大规模培养以及外源基因表达产物的分离纯化过程基因工程的基本过程（1）从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA（含外源基因或目的基因）和载体分子切开（简称“切”） （2）用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片断接到载体上，形成DNA重组分子（简称“接”） （3）借助于细胞转化手段

28、将DNA重组分子导入受体细胞中（简称“转”）（4）短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中（“增”）； （5）筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效表达的基因工程菌或细胞（简称“检”） 由此可见，基因工程的上游操作过程可简化为：“切、接、转、增、检”五步；工具酶：在重组DNA技术中，对DNA进行切割、合成、剪接、补平、连接和修饰等工具酶是必不可少的。常用的工具酶主要有：一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease，简称限制酶），分为三型。其中型被称为基因工程的分子手术刀，是分子克隆技术中最重要的工具酶。二、DNA聚合酶 三、DNA连接酶

29、四、碱性磷酸酶 五、T4多核苷酸激酶 六、核酸酶S1回文结构（palindrome structure）：指双链DNA分子上按对称轴排列的反向互补序列（常为限酶所识别）粘性末端（stickyend）：指限制酶错位切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端。平末端（bluntend）：指限制酶平齐切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端。同工异源酶（isoschizomers）:来源不同，但能识别和切割同一位点的酶称为。同尾酶（isoaudamers）:识别序列不同，但可产生相同粘性末端的限制酶称为大肠杆菌DNA聚合酶E . Coli DNA polymerase是单一多肽链的多功能酶具有3种酶活

30、性： 53DNA聚合酶活性聚合作用:在引物的存在下，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApol逐个将核苷酸加上去，就是DNApol的53聚合作用35核酸外切酶活性校对作用这种酶活性的主要功能是从35方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸53核酸外切酶活性切除修复作用从53方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5-脱氧核苷酸Klenow片段的主要用途：补齐双链DNA的3末端，同时可使3 末端DNA标记同位素。cDNA克隆中，合成cDNA第二链。DNA序列分析（二）TaqDNA聚合酶（简称Taq酶）是一种耐热的DNA聚合酶，分子量为65Kd最佳作用温度是7080，Taq酶具

31、有53聚合酶活性和依赖于聚合作用的53外切酶活性TaqDNA聚合酶可用于DNA测序及通过聚合酶链反应（PCR）对DNA分子的特定序列进行体外扩增（三）逆转录酶（reverse transcriptase）是依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板，4种dNTP为底物，催化合成DNA，此过程称为逆转录过程。是多功能酶逆转录酶的作用：RNA指导的DNA聚合酶活性（RDDP）核糖核酸酶H活性（RNaseH）: 35RNA外切酶活性依赖DNA的DNA聚合酶活性（DDDP）（四）末端脱氧核苷酰转移酶“搬运工”（terminal deoxynucleotidyltransferase，TdT，简称末端转

32、移酶）分子量为60Kd，在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3末端-OH上末端转移酶的功能在载体或目的基因3末端加上互补的同质多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重组连接用于DNA 3末端的同位素探针标记三、DNA连接酶（DNA ligase）基因工程的”缝纫针”主要功能：催化两个互补粘性末端或平末端双链DNA分子的5磷酸基团与3羟基形成磷酸二酯键，将具有相同粘性末端或平末端的DNA连接起来，实现DNA体外重组四、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）的作用是催化去除DNA，RN或dNTP上的5-磷酸基团。主要用途：除去DNA片段上的5磷酸以防自身

33、连接在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素标记前，从RNA或DNA上除去5端的磷酸五、T4多核苷酸激酶前向反应交换反应六、核酸酶S1可水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交分子中的单链部分其主要作用：除去的粘性末端以产生平末端除去cDNA合成时形成的发夹结构分析RNA的茎环结构和DNA-RNA分子的杂交情况功能：水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交体中的单链部分载体（vector）: 指能携带外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具。载体的本质为DNA.制备的目的基因或外源性DNA片段必须与合适的载体连接形成重组体，才能进入受体细胞并进行复制和表达载体包括克隆载体和表达载体在常用

34、的克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件（DNA序列）即为表达载体不仅可携带外源基因片段进入宿主细胞而且可在宿主细胞中表达外源基因载体应具备的特征能自我复制并具较高的拷贝数。分子量一般 10Kb。带有遗传筛选标记。有适当的限制酶切位点，便于外源基因的插入和筛选。多克隆位点 （multiple cloning sites，MCS）：载体上具有多个限制性内切酶的单一位点（即在载体的其它部位无这些酶的相同位点），以供外源DNA插入。一、克隆载体能将载体外源基因在受体细胞中复制扩增并产生足够量目的基因的载体称为克隆载体（一）质粒载体质粒（plasmid）是指细菌染色体以外的小分子环状双链DNA，能自我

35、复制和表达其携带的遗传信息质粒克隆载体的主要用途：用于保存和扩增 2Kb目的DNA构建cDNA文库目的DNA的测序作为核酸杂交时的探针来源表达载体是指能将外源基因在受体细胞中有效转录和正确翻译的载体。启动子是一段位于结构基因5端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合并具有转录起始的特异性。转录单元(transcription unit)一段从启动子开始至终止子(terminator)结束的DNA序列一个基因的3末端有一特定的DNA序列，它具有被RNA聚合酶识别并停止转录的功能，此序列称为终止子分子克隆的基本步骤“分、切、接、转、增、检”一、目的基因的获取和载体的选择一

36、、目的基因的获取从基因文库中获取逆转录法人工合成DNA片段直接从染色体DNA中分离目的基因二、目的基因和载体分别被酶切与连接三、目的基因与载体连接四、重组DNA导入受体细胞五、重组体的克隆六、重组体的筛选和鉴定基因组文库（genomic library，G-文库）是指含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群构建基因组文库的步骤先将原核或真核细胞染色体DNA提纯通过机械或酶切使之成为一定大小的片段将其与适当的载体（一般为噬菌体）相连接经体外包装、转染细菌得到一组含不同DNA片段的重组噬菌体颗粒这个文库中含有基因组内全部基因片段，是一个贮存基因组全部序列的信息库，故称为G-文库如以细胞全部m

37、RNA经逆转录，制备出全套cDNA建库，则称为C-文库。细胞膜结构改变、通透性增加并具有摄取外源DNA能力的细胞称谓感受态细胞(competent cell) 某些质粒载体带有大肠杆菌乳糖操纵子的lacZ基因，该基因含一段编码-半乳糖苷酶氨基末端145个氨基酸-肽的DNA片段，IPTG可诱导此片段合成，此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型-半乳糖苷酶实现基因内-互补，形成完整的-半乳糖苷酶。该酶能催化指示剂底物X-gal 形成蓝色菌落。当外源基因插入lacZ基因中MCS，lac-肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无-半乳糖苷酶活性，结果重组克隆呈白色菌落，这是常用的蓝白斑筛选实验基因工程的基本原理（1）利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复制的特性，将外源基因与载体分子重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量，借此提高其宏观表达水平（2）筛选、修饰和重组启动子、增强子、操作子、终止子等基因的转录调控原件，并将这些原件与外源基因精细拼接，通过强化外源基因的转录提高其表达水平