实用免疫细胞与核酸课件模板-113(共116)

1、实用免疫细胞与核酸 课件模板-113,实用免疫细胞与核酸：一、国内实验室应用试剂配制,一、国内实验室应用试剂配制：,（一）培养液 （1）RPMI1640培养液：称取RPMI培养基9.8g，碳酸氢钠1.9g、青霉素100u/ml，加双蒸水至1000ml，调节pH7.27.4无菌过滤冻存备用。 （2）小牛血清商品：成都生物制品厂。 （3）植物凝集素（PHA）：自制或成品（重庆药检所）。 （4）pH调整液：5%NaHCO3溶液高压灭菌（8磅15min），0.1N稀盐酸液100ml。,实用免疫细胞与核酸：一、国内实验室应用试剂配制,一、国内实验室应用试剂配制：,（5）秋水仙素：10mg/ml无菌过滤高

2、压灭菌（8磅10min）。 （6）磷酸缓冲液：pH7.4。 磷酸氢二钠28.8g(H2O)、磷酸二氢钾2.67g(无水)，溶于1000ml双蒸水中，加肝素，终浓度为100u/ml。 （7）Giemsa染色液： Giemsa粉剂1g 甘油66ml 在研钵中，加入少量甘油油仔细研磨然后放甘油全部加磨，60温箱中保温2h，冷却后加入甲醇66ml。,实用免疫细胞与核酸：一、国内实验室应用试剂配制,一、国内实验室应用试剂配制：,装入有色瓶中混合待用。染色时用pH7.4磷酸缓冲液稀释10倍，随配随用。 （二）固定液 （1）甲酸：冰乙酸3：1混合即用。 （2）PBS缓冲液配制： NaCl 16gNa2HPO

3、4(12H2O)5.65g KCl0.4g KH2PO40.4g 加双蒸水至1000ml pH7.0。,实用免疫细胞与核酸：一、国内实验室应用试剂配制,一、国内实验室应用试剂配制：,取5%胰酶（生理盐水配制）1ml加入50ml PBS液中（最终浓度为0.025%），4冰箱待用。,实用免疫细胞与核酸：二、细胞培养（Bhatl B和McGee JOD,1990）,二、细胞培养（Bhatl B和McGee JOD,1990）：,1。完全培养基 RPMI76.0ml 胎牛血清 20.0ml 植物凝集素2.0ml 抗生素/抗菌素溶液（100）1.0ml L-谷氨酰胺（100）1.0ml 2.BudR(5

4、-Bromo-2-deoxyuridine,5-溴-2-脱氧尿嘧啶)溶解10mg/ml BudR于dH2O中，0.2m滤膜过滤除菌，分装后-20储存，BudR要在柔光（弱光）下操作。,实用免疫细胞与核酸：二、细胞培养（Bhatl B和McGee JOD,1990）,二、细胞培养（Bhatl B和McGee JOD,1990）：,3。胸腺嘧啶（Thymidine,Thd）按250g/ml溶解于dH2O中，过滤后分装储存于-20。 4。Colcemid(Sigma)5.0g/ml溶于dH2O中，过滤后分装储存于-20。 5。KCl（0.75mol/L）溶解560mg于100ml dH2O中，新鲜配

5、制37保存。,实用免疫细胞与核酸：二、细胞培养（Bhatl B和McGee JOD,1990）,二、细胞培养（Bhatl B和McGee JOD,1990）：,6。固定剂甲醇冰醋酸按3：1（V/V）混合即可，现用现配，置冰上待用。 7。缺口平移试剂盒（Amersham和BRL公司） 8。生物素7-dATP(BRL) 9.糖原（BRL） 10。RNA酶A（Sigma） （1）储备液 称取RNA酶A 1g溶于100ml醋酸钠中，置沸水中煮10min，分装后储于-20。,实用免疫细胞与核酸：二、细胞培养（Bhatl B和McGee JOD,1990）,二、细胞培养（Bhatl B和McGee JOD

6、,1990）：,（2）工作液 用储备液按1：100稀释。 11。20SSC NaCl 175g 柠檬酸三钠 88g dH2O1000ml 固定试剂溶解后，dH2O定容至1000ml，调pH至7.4，高压灭菌。 12。杂交液（高深度，HMmix） 去离子甲酰胺 6.0ml 100Denhardts液1.0ml 50%硫酸葡聚糖 2.0ml 1%人或鲑精DNA 20SSC ：临用前加入，终浓度为100200g/ml。,实用免疫细胞与核酸：二、细胞培养（Bhatl B和McGee JOD,1990）,二、细胞培养（Bhatl B和McGee JOD,1990）：,该液为高浓度杂交液， 存于4。 13

7、。PBT液 BSA 5% TristonX-100/(PBS) 0.1% 注：BSA液用前应用Whatman 3mm滤纸过滤。 14。兔抗生物素（-生物素）单克隆抗体 用PBT液1：100稀释。 该单抗现可从英国Dako公司购得。 15。,实用免疫细胞与核酸：二、细胞培养（Bhatl B和McGee JOD,1990）,二、细胞培养（Bhatl B和McGee JOD,1990）：,金（1020nm）标羊抗兔二抗 用PBT液1：50稀释。 16。银溶液（Janesen） 17.Hoedst33258（Sigma） 储备液（100） Hoedst染料 5mg 甲醇 10ml 工作液：用2SSC

8、1：100稀释储备液。,实用免疫细胞与核酸：一、核酸及蛋白质常用数据,一、核酸及蛋白质常用数据：,1。 化合物分子量max(pH7.0)1摩尔溶液（pH7.0）中max时的最大吸收值OD280/OD260ATP507259154000.15CTP48327190000.97GTP523253137000.66UTP484262100000.38dATP494259152000.15dCTP46727193000.98dGTP507253137000.66dTTP48226796000.71 2。,实用免疫细胞与核酸：一、核酸及蛋白质常用数据,一、核酸及蛋白质常用数据：,常用核酸的长度与分子量

9、核酸核苷酸数分子量DNA48502（双链环状）3.0107pBR3224363（双链）2.810628SrRNA48001.610623SrRNA37001.210618SrRNA19006.110519SrRNA17005.51055SrRNA1203.6104tRNA（大肠杆菌）752.5104 3。,实用免疫细胞与核酸：一、核酸及蛋白质常用数据,一、核酸及蛋白质常用数据：,常用核酸蛋白换算数据 （1）重量换算 1g=10-6g 1pg=10-12g 1ng=10-9g 1fg=10-15g （2）分光光度换算： 1A260双链DNA=50g/ml 1A260单链DNA=30g/ml 1A

10、260单链RNA=40g/ml （3）DNA摩尔换算： 1g 100bp DNA=1.52pmol=3.03pmol末端 1g pBR322 DNA=0.36pmol 1pmol 1000bp DNA=0.66g 1pmol pBR322=2.8g 1kb双链DNA（钠盐）=6.6105道尔顿 1kb单链DNA（钠盐）=3.3105道尔顿 1kb单链RNA（钠盐）=3.4105道尔顿 （4）蛋白摩尔换算： 100pmol分子量100，000蛋白质=10g 100pmol分子量50，000蛋白质=5g 100pmol分子量10，000蛋白质=1g 氨基酸的平均分子量=126.7道尔顿 （5）蛋白

11、质/DNA换算： 1kb DNA=333 个氨基酸编码容量=3.7104MW蛋白质 10，000MW蛋白质=270bp DNA 30，000MW蛋白质=810bp DNA 50，000MW蛋白质=1.35kb 100，000MW蛋白质=2.7kb DNA 4。,实用免疫细胞与核酸：一、核酸及蛋白质常用数据,一、核酸及蛋白质常用数据：,常用蛋白质分子量标准参照物 （1）高分子量标准参照（2）中分子量标准参照（3）低分子量标准参照肌球蛋白分子量磷酸化酶B97，400碳酸酐酶31，00肌球蛋白212，000牛血清白蛋白66，200大豆脻蛋白酶21，500-半乳糖甘酶B116，000谷氨酶脱氢酶55，

12、000抑制剂磷酸化酶B97，400卵白蛋白42，700马心肌球蛋白16，900牛血清白蛋白66，200醛缩酶40，000溶菌酶14，400过氧化氢酶57，000碳酸酐酶31，000肌球蛋白（F1）8，100醛缩酶40，000大豆脻蛋白酶21，500肌球蛋白（F2）6，200抑制剂肌球蛋白（F3）2，500溶菌酶14，400 5。,实用免疫细胞与核酸：一、核酸及蛋白质常用数据,一、核酸及蛋白质常用数据：,常用DNA分子量标准参照物 DNA/HindDNA/EcoR/Hind+EcoRpBR322/Hae23130212262122758712394167421514840510465575804

13、497350489436156434268458802322484335304346420273530202726757564190423451125158421321137519218974184118311247564125 续上表 pBR322/Hinf174/Hinf174/Hae 174/Tap16317261401353291451771311810781175506553100872404396500826033273444176631023129841348281141221311422718722024940234541542002419433751511182072。,实用

14、免疫细胞与核酸：二、常用缓冲液,二、常用缓冲液：,1。分子克隆常用缓冲液 2。磷酸缓冲液 （1）25下0.1mol/L磷酸钾缓冲液的配制 pH1mol/L K2HPO4(ml)1mol/L KH2PO4(ml)5.88.591.56.013.286.86.219.280.86.427.872.26.638.161.96.849.750.37.061.538.57.271.728.37.480.219.87.686.613.47.890.89.28.094.06.2 （2）25下0.1mol/L磷酸钠缓冲液的配制 pH1mol/L Na2HPO4(ml)1mol/L NaH2PO4(ml)5.8

15、7.992.16.012.088.06.217.882.26.425.574.56.635.264.86.846.353.77.057.742.37.268.431.67.477.422.67.684.515.57.889.610.48.093.26.8 :用蒸馏水将混合的两种1mol/L贮存液稀释至1000ml，根据Henderson-Hasselbalch方程计算其pH值： pH=pK+1g(质子受体/质子供体) 在此，pK=6.86(25)。,实用免疫细胞与核酸：二、常用缓冲液,二、常用缓冲液：,3。电泳缓冲液 测序凝胶加样缓冲液 98%去离子甲酰胺 10mol/L EDTA(pH8.0

16、) 0.025%二甲苯青FF 0.025%溴酚蓝 甲酰胺：许多批号的试剂级甲酰胺，其纯度符合使用要求，无须再进行处理。不过，一旦略呈黄色，则应用在磁力搅拌器上将甲酰胺与Dowex XG8混合床树脂共同搅拌1小时进行去离子处理，并用Whatman 1号滤纸过滤2次，去离子甲酰胺分装成小份，充氮存于-70。,实用免疫细胞与核酸：二、常用缓冲液,二、常用缓冲液：,常用的电泳缓冲液 缓冲液使用液浓贮存液（每升）Tris-乙酸（TAE）1：0.04mol/L Tris-乙酸50：242gTris碱0.001mol/L EDTA57.1ml冰乙酸100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)Tris

17、-磷酸（TPE）1:0.09mol/L Tris-磷酸10:10gTris碱0.002mol/L EDTA15.5ml85%磷酸（1.679g/ml）40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)Tris-硼酸（TBE）a0.50.045mol/L Tris-硼酸5：54gTris碱0.001mol/L EDTA27.5硼酸20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)碱性缓冲液b1:50mmol/L NaOH1:5ml 10mol/L NaOH1mmol/L EDTA2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)Tris-甘氨酸c1:25mmol/L Tris5:15.1gTri

18、s250mmol/L 甘氨酸94g苷氨酸（电泳级）（pH8.3）0.1% SDS50ml 10% SDS(电泳级) 说明： TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存5溶液，出现沉淀后则予以废弃。,实用免疫细胞与核酸：二、常用缓冲液,二、常用缓冲液：,以片都以1TBE作为使用液（即1：5稀释浓贮液）进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖胶电泳都以1：10稀释的贮存液作为使用液。 进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小， 故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使用1TBE以提供足够的缓冲容量。,实用免疫细胞与核酸：二、常用缓冲液

19、,二、常用缓冲液：,碱性电泳缓冲液应现用现配。 Tris-甘氨酸缓冲液用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。 2SDS凝胶加样缓冲液： 100mmol/L TrisHCl(6.8) 200mmol/L二硫苏糖醇（DTT） 4%SDS（电泳级） 0.2%溴酚蓝 20%甘油 不含DTT的2SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，应在临用前取1mol/L贮存液现加于上述缓冲液中。,实用免疫细胞与核酸：二、常用缓冲液,二、常用缓冲液：,4。凝胶加样缓冲液 缓冲液类型6缓冲液贮存温度0.25%溴酚蓝40.25%二甲苯青FF40%（W/V）蔗糖水溶液0.25溴酚蓝室温0.25%二甲苯青FF15%聚蔗糖(Ficoll400

20、)0.25%溴酚蓝40.25%二甲苯青FF30%甘油水溶液0.25%溴酚蓝440%(W/V)蔗糖水溶液碱性加样缓冲液:300mmol/L NaOH6mmol/L EDTA18%聚蔗糖(Ficoll400)40.15%溴甲酚绿0.25%二甲苯青FF 使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品密度；以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利，含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。,实用免疫细胞与核酸：二、常用缓冲液,二、常用缓冲液：,溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍，而与琼脂糖浓度无关。以0.5TBF作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长3

21、00bp的双链线状DNA相同，而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。在琼脂糖浓度为0.5%1.4%的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。,实用免疫细胞与核酸：二、常用缓冲液,二、常用缓冲液：,选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性pH条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。 5。各种pH值的Tris缓冲液的配制 各种pH值的Tris缓冲液的配制所需pH值（25）0.1mol/L HCl的体积7。145。77。244。77。,实用免疫细胞与核酸：二、常用缓冲液,二、常用缓冲液：,343。47。442。07。540。37。638。57。736。67。834。57。932。08。029。28.126.28.222.98.319.98.417.28.514.78.612.48.710.38.88.58.97.0 某一特定pH值的0.05mol/LTris缓冲液