蛋白酶.ppt

1、食品酶学专题 蛋白酶,LOGO,内 容,LOGO,蛋白酶：水解蛋白质肽键的一类酶的总称。 广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。,1：蛋白酶简介,1.1:蛋白酶的定义,LOGO,一：按照酶水解多肽的方式分 内肽酶 外肽酶 二：按照酶的来源来分 动物蛋白酶 植物蛋白酶 微生物蛋白酶 三：按照酶作用的最适pH值分 酸性蛋白酶 中性蛋白酶 碱性蛋白酶 四：按照酶的活性中心分 丝氨酸蛋白酶 半胱氨酸蛋白酶 天门冬氨酸蛋白酶 金属蛋白酶,1.2:蛋白酶的分类,LOGO,2.1：酸性蛋白酶： （一）酸性蛋白酶是一种羧基蛋白酶。 （二） pI3-5；分子量30000-40000；最适pH 3-4；

2、稳定pH2-6 。 （三）50以上不稳定。 （四）广泛存在于霉菌，酵母菌，担子菌中。 (五) 抑制剂为DAN（二重氮乙酰正亮氨酸甲 酯）,EPNP（1,2-环-3-对硝基苯氧基丙烷）,SDS,2：蛋白酶性质,LOGO,2.2：中性蛋白酶 （一）大多数是金属酶；分子量35000- 40000； pI8-9；不稳定，易自溶。 （二）最适pH6.5-7.5，稳定pH6-10。 （三）热稳定性较差。,LOGO,LOGO,2.4：丝氨酸蛋白酶 (一)：活性中心含丝氨酸残基， (二)：酶活性受到DF、PMSF和PI等的专一性抑 (三)：酶的最适pH值在9.5一10.5，是碱性蛋白酶， (四) ：产生碱性丝

3、氨酸蛋白酶的微生物有节杆菌、 链霉菌、黄杆菌和芽抱杆菌等细菌，在酵母、 链抱霉、曲霉和担子菌等真菌中也存在。 (五) ：丝氨酸蛋白酶这类酶广泛存在于动物胰脏、 细菌和霉菌中， (六)： 举例如弹性蛋白酶，胰蛋白酶，枯草杆菌碱性蛋白酶。,LOGO,这类酶也叫琉基蛋白酶，已知这类酶约有20族，广泛存在于原核生物和真核生物中，其活性中心含一双氨基酸即Cys一His，不同族的酶中Cys与His前后顺序不同。通常这类酶需有还原剂如HCN或胱氨酸存在下才有活性。根据它们侧链的专一性可分为4群:木瓜蛋白酶型、胰蛋白酶型(可优先切开精氨酸残基)、对谷氨酸有专一性和其它。,2.5：半胱氨酸蛋白酶,LOGO,2.

4、6：天门冬氨酸蛋白酶,胃蛋白酶和真菌酸性蛋白酶都是活性中心含天门冬氨酸的酸性蛋白酶，这类酶的最适pH值为2.0一5.0，在酸性条件下稳定，在pH值高于6时迅速失活，酶的pl为3一4.5，DAN和EpNP是这类酶的专性抑制剂，,LOGO,2.7：金属蛋白酶,（一）：主要是中性蛋白酶。 （二）：最适pH值为7-8。 （三）：活性中心大多数含Zn2+等二价金属， 可收到金属鳌合剂EDTA或OP的抑制。 （四）：广泛存在于曲霉、芽孢杆菌和链霉菌等中，许多曲霉除产生中性蛋白酶外还产生碱性和酸性蛋白酶及外肽酶，芽孢杆菌有的菌株还同时可产生碱性蛋白酶，但也有些芽孢杆菌只产中性蛋白酶一种。,LOGO,3.1：

5、提取法（以菠萝蛋白酶为例）,3.1.1高岭土吸附法,3：蛋白酶的生产,LOGO,3.1.2单宁沉淀法,LOGO,3.1.3有机溶剂提取法,LOGO,高岭土吸附方法生产工艺和操作都比较复杂，原料消耗多，所需设备也多，酶活总回收率也低，但是产品质量 较好，纯度较高，可达到医药级，由于加入了高岭土和盐析工艺，对环境造成未然，环保投资较大。 单宁沉淀法工艺和操作简单，原材料消耗少，所需设备也少，但是酶活回收率比较低，部分产品只能达到食品级，由于加入单宁，因此对环境污染也大，环保投资大。 超滤法浓缩有机溶剂提取生产工艺和操作比上述两种方法更复杂，超滤膜的使用、清洗、,3.1.4三种方法的比较,LOGO,

6、保护操作技术含量要求高，设备一次性投资大，而且必须有回收有机溶剂的设备-精馏塔，由于有机溶剂需要温度更低，生产成本上升，当年事超滤透过液可作为饮料添加剂，有机溶剂可以回收再生产，基本上没有废物排放，可以达到清洁生产的要求，产品质量好，纯度高，回收率高，产品酶活力高，达到医药级。,LOGO,3.2：微生物生产,微生物生产所用的菌种,LOGO,4.1固定化酶的优点： 与游离酶相比固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时又克服了游离酶的不足之处，呈现储存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等优点。固定化酶的研究在化学、生物学、生物工程医学及生命科学等领域异常活

7、跃。非催化功能，用于帮助分离( 如从应用微环境中分离催化剂，重复使用催化剂，特别用于控制加工过程) ；催化功能，在特定的时间和空间内转化目标产物。,4：固定化及活力测定,LOGO,4.2固定化酶的主要任务：,（1）确定条件：pH 值、温度和介质的性质 （2）根据和酶的来源、性质和纯度来设计固定化催化剂。 （3）选择载体: ： 即固定化酶的非催化部分，催化部分构建的位置。无机材料、天然高分子材料、合成高分子材料以及复合材料(壳聚糖和纳米材料用的比较多),LOGO,4.3蛋白酶的固定化方法： （1）吸附法 ：利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。通常有物理吸附法和离子吸附法。

8、常用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。 其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。,（2）共价结合法：即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接参加和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。,LOGO,（3）交联法 ：依靠双功能团试剂使酶分子之间发生交联凝集成网状结构，使之不溶于水从而形成固定化酶。常采用的双功能团试剂有戊二醛、顺丁烯二酸酐等。酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。 （4）包埋法 ：酶被裹在凝胶的细格子中或被半透性的聚合物膜包围而成为格子型和微胶囊型两种。包埋法制备固定化酶除包埋水溶性酶外还常

9、包埋细胞，制成固定化细胞，例如可用明胶及戊二醛包埋具有青霉素酰化酶活力的菌体，可连续水解青霉素，工业生产6-氨基青霉烷酸。 酶经过固定化后，比较能耐受温度及pH的变化，最适pH往往稍有移位，对底物专一性没有任何改变，实际使用效率提高几十倍（如5-磷酸二酯酶的工业应用）甚至几百倍（如青霉素酰化酶的工业应用）。,LOGO,以壳聚糖为载体的固定,具体方法为： 壳聚糖2.5g于99ml 去离子水中磁力搅拌10min，加1ml 乙酸，室温搅拌3h，4过夜。将壳聚糖溶液逐滴滴入凝结液，凝结3 h ，壳聚糖将凝聚成白色颗粒，用去离子水充分洗涤至中性。载体经0.5% 戊二醛活化2h，加一定量pH7.0 Tri

10、s-HCl 缓冲液，7mg/ml 胰蛋白酶溶液10条件下振荡固定化18h，载酶量达到30.72mg/g湿载体，固定化酶活力72.39U/g(以酪蛋白为底物，pH8.0 Tris-HCl 缓冲液40，1min 内产生1g 酪氨酸的酶量为一个活力单位)。壳聚糖与粘土、活性炭等天然吸附类材料耦合制备凝胶可以克服单一壳聚糖凝胶密度小易漂浮于底物表面，影响传质的缺点，且能增大凝胶机械强度使结构更加紧密有序。,LOGO,以纳米材料为载体的固定,固定过程： 制备纳米粒子载体粒子表面修饰加入交联剂和酶液搅拌反应回收沉淀冷冻干燥固定化酶,LOGO,原理：修饰之后的纳米粒子表面外部有-NH2，所要固定的碱性蛋白酶

11、上也有游离的-NH2，交联剂戊二醛中的两个醛基可以与之发生希夫碱反应，从而将两个含-NH2的化合物共价键连接，达到固定酶的目的。,LOGO,（1）福林法: 原理：蛋白酶在一定的温度下和pH条件下水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，在碱性条件下，将福林试剂(Folin)还原，生成钼蓝和钨蓝，用分光光度计测定，计算其酶活力。 反应条件如下： 温度：1398和166蛋白酶的反应温度为30 ，其他酶为40(国标)。 pH值：由酶的种类决定。 反应时间：10min 在40下每分钟水解酪蛋白产生1g酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。,4.4酶活力测定方法,LOGO,样品蛋白酶活力单位

12、（干基）=（A/10）4 N 1/(1-W). A-由样品测得OD值,查标准曲线得相当的酪氨酸微克数(或OD值K); 4-4毫升反应液取出1 mL测定 (即4倍); N-酶液稀释的倍数; 10-反应10min; W-样品水分百分含量。 此方法只适用于中性蛋白酶，对于酸性和碱性蛋白酶，则把配制酪蛋白溶液和稀释酶液用的pH缓冲液换成相应pH缓冲液即可,LOGO,（2）甲醛法： 原理：实质上是在一定温度下、一定时间内,成曲利用自身的蛋白酶把自身原料中的蛋白质水解成氨基酸。以测定氨基态氮的量来衡量蛋白酶活力的数值。 计算酶活力： 蛋白酶活力（壳氨基态氮/100g)(干基)=（V*V0） N 0.014

13、 100/(1-w),V加入甲醛后氢氧化钠标准液滴定数, mL; *Vo甲醛空白滴定数, mL; W曲水分,%; N氢氧化钠标准溶液的当量数,N; 0.014氮的毫克当量数。,LOGO,5.1在洗涤剂工业的应用： 全世界洗涤液的年产量达到1.3亿吨，在欧洲加酶洗衣粉的比例达到80%左右，美国45%以上的洗涤剂加酶，日本也达到60%以上，全世界碱性蛋白酶的销售额约占世界酶制剂市场的25%，适合做洗涤用的碱性蛋白酶符合以下条件： 1专一性要广，以便对食物、血液、汗渍等分泌物污渍有效分解。 2;在洗涤剂更重助剂如螯合剂和氧化剂共存下稳定，适用于洗涤剂的碱性蛋白酶的等电点应与洗涤液的pH保持一致。,5

14、：蛋白酶的应用,LOGO,5.2:在制革工业的应用： 原料皮的95%是蛋白质，其中纤维蛋白质胶原约占93%，是制革的有用部分，制革工艺的前处理是浸渍、脱脂、脱毛和软化，将原料皮的残肉、脂肪、毛和胶原间隙蛋白去除，以前使用的烧碱和硫化钠对环境污染大，蛋白酶不作用于胶原，只水解角蛋白、弹性蛋白和球蛋白等杂质，在浸水时刻促进皮子吸水，脱毛时刻分解毛皮与表皮间连接的类粘蛋白，使胶原松散，使鞣制后的皮革柔软。,LOGO,5.3：在食品工业的应用：: a：用于干酪的生产 b:用于蛋白质水解物脱苦 c:风味调料的生产 d:用于酱油的生产 e:用于焙烤食品和肉类嫰化 f:合成二肽甜味剂阿斯巴甜 g:用于茶叶生产 h:用于多肽的制造,LOGO,L