分子生物学-第三章-下转录后加工VIP

1、第三章 (下) 转录后加工,转录后的加工（posttranscriptional modification） （1）减少部分片段：如切除5端前导序列， 3端拖尾序列和中部的内含子； （2）增加部分片段：5加帽，3加poly(A), 归巢和通过编辑加入一些碱基； （3）修饰：对某些碱基进行甲基化等。,第一节tRNA和rRNA的加工,一. 原核的 tRNA和 rRNA的加工 参与蛋白质合成的tRNA和rRNA都不是最初的转录产物 (1) 它们的5端都是单磷酸，而原始的转 录产物5应是三磷酸； (2) 分子比初始转录物小； (3) tRNA含有特殊的碱基，这些碱基只有通过一些化学修饰才可以得到。,表

2、13-1 E.coli中含有的小分子核酸酶 酶 基因 底物 功能 RNaseP rnpA tRNA 5端 内切 RnaseO rnpB RnaseBN ? tRNA 3端 外切 RnaseD rnd tRNA 3端 外切 RnaseT ? tRNA 3CCA 外切 Rnase rnc rRNA和mRNA 内切 RnaseR ? rRNA和mRNA 外切 RnaseE rne 5S rRNA 内切 Rnase rna 大部分RNA 内切 Rnase rnb RNA 外切 多核苷酸磷酸化酶 pnp RNA 外切 RnaseH rnh RNA-DNA杂合链 内切 GENESIV，1990. B. L

3、ewin, Table 14.2,(一) tRNA的加工,tRNA的加工分成3个阶段 (1) “斩头”，形成5末端； (2) 去尾，形成3-OH末端。缺-CCA的 tRNA要用tRNA核酸转移酶加-CCA。 (3)修饰：通过甲基化酶，硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等进行修饰，如氨基酸臂的4-硫尿苷（4tu），D臂的2甲基鸟苷（2mG），TC臂的假尿苷（）和反密码子环上的2异戊腺苷（2ipA),Mature tRNA,真核tRNA内含子的特点：,位置相同，都在反密码子环的下游； 不同tRNA的内含子长度和序列各异； 外显子和内含子交界处无保守序列； 内含子的剪切是依靠RNase异体催化； 内含子和反密

4、码子配对形成茎环。,二 真核的tRNA和rRNA的加工,真核tRNA的基因和原核不同： (1)真核的前体分子tRNA是单顺反子，但成 簇排列，基因间有间隔区； (2)真核tRNA基因一般都比原核tRNA基因多 得多，如酵母约有400个tRNA基因； (3) 5端单磷酸核苷酸，表明已被加工过； (4) tRNA的前体分子中含有内含子。,真核tRNA内含子切除的特点：,(1)没有交界序列，也没有内部引导序列； (2)剪切反应的信号是二级结构，而不是 一 级结构； (3)是依赖于蛋白质性的RNase，而不是核 糖拟酶或snRNP； (4)反应的本质不是转酯反应。,酵母tRNA前体内含子3和5端的剪切

5、是由内切酶的不同亚基催化的。亚基Sen34, Sen2剪切3端和5端.Sen54可能通过量度成熟结构域的距离来决定5端剪切位点的位置。A1碱基对也是重要的。,古细菌tRNA用于剪切的核酸内切酶在每个“突起螺旋突起”片段的突起处切割每条链,真核tRNA的加工和原核的区别,(1)真核tRNA前体中无二聚体和多聚体； (2)增加了剪接内含子的过程； (3)都要加CCA。,真核细胞中rRNA的加工途径,(1) 切除5端的前导序列； (2) 从41S的中间产物中先切下18S的片段。 Hela细胞的切点在18S和5.8S之间的ITS（内部转录间隔序列）； L细胞的切点在 18S序列和ITS的交界处，称为先

6、成熟。 (3) 部分退火，形成发夹结构； (4) 最后修正。,第二节 前体mRNA的加工,mRNA前体分子的加工主要是真核mRNA，原核的mRNA一般不经过加工。 真核mRNA的加工一般要经过四步： (1) 5加帽； (2) 3加尾； (3) 切除内含子； (4) 修饰：对某些碱基进行甲基化。,原核生物mRNA的加工,原核生物的mRNA很少经过加工，但在少数情况下多顺反mRNA先被内切核酸酶切成较小的单位再成为翻译的模板,二 真核mRNA前体的加工,(一)核内不均一RNA（heterogenous nuclear RNA,hnRNA）平均分子长度为8-10Kb(2Kb14Kb)左右。比mRNA

7、的平均长 度（1.8-2Kb）要大4-5倍。 hnRNA仅有总量的1/2转移到细胞质内，其余的都在核内被降解掉。 hnRNA是mRNA的前体，证据是： (1) hnRNA和mRNA有相同的序列； (2) hnRNA在体外能作为模板翻译蛋白； (3) 两者5端都有帽子结构； (4)表明二者为相同的聚合酶所合成； (5) 两者的3端都有多聚腺苷有尾巴。,hnRNA的结构的特点,(1)5端有帽结构； (2) 3端有poly（A）尾巴； (3)帽结构后有3个寡聚U区，每个长约30nt； (4)有重复序列，位于寡聚U区后面； (5)有茎环结构，可能分布于编码区（非重复序列）的两侧； (6)非重复序列中有

8、内含子区。,hnRNA的物理结构是核糖核蛋白颗粒（hnRNP）,颗粒中蛋白质包围着hnRNA。体外研究表明hnRNA的形状是一个球体和一个与之相连的纤维状结构。,在细胞核中，RNA加工包括3端和5端修饰以及内含子的去除等。剪切需要在内含子与外显子交界处产生断裂，然后将外显子末端连接。成熟的mRNA通过核孔被运到细胞质中，在那里它完成翻译。,1加帽,(1) 剪接前加帽 如呼肠病毒， 牛豆病毒 (2) 剪切后加帽 如疱疹病毒和口炎病毒,7甲基鸟苷三磷酸,帽子 的类型,在末端鸟苷的第7位上存在单个甲基化位点的称0型帽子（cap0）； 在次末端核苷酸的核糖上的2-o位点上还有一个甲基位点的称1型帽子(

9、cap 1)； 此外，在第三个核苷酸的核糖上（2-o）有甲基化位点的称2型帽子（cap2）。 这三种帽子都有特殊面对面核苷酸结构（confrontde nucleotide structure）。,帽子结构的功能,(1)有助于mRNA越过核膜，进入胞质； (2)保护5不被酶降解； (3)翻译时供IF（起始因子）和核糖体识别。,(2) 加尾,(1) CPSF特殊组分 cleavage and polyadenylationspecificity factor剪切和多聚腺苷酸化特异因子 识别AAUAAA并指导其它的活性 (2) CF (剪切因子)在加尾位点 AAUAAA下游1130nt 处剪切RN

10、A； (3)PAP 末端腺苷转移酶poly(A)聚合酶合成 poly(A)尾巴； (4)PBP（poly(A)结合蛋白 与poly(A)结合，反应停止。,加Poly(A)的反应,第一步加一个短的寡聚A序列（10nt），此反应依赖于AAUAAA序列； 反应由poly（A）聚合酶在特殊因子指导下完成的。 第二步是寡聚A尾巴延伸到240nt的长度。 此反应并不需要AAUAAA序列，但需要一个识别寡聚A并指导poly（A）聚合酶延伸的刺激因子。,加工的要素是：(1)热敏因子，功能不祥；(2)剪切位点的发夹结构（和序列无关，与二级结构有关）；(3)U7snRNA,长56nt,其5端有一保守序列和H3mR

11、NA剪切点下游的GAAAGA互补。,有些mRNA的3端无poly(A)尾，如在爪蟾卵母细胞中组蛋白H3的mRNA.成熟时要切除一段3端序列。,第三 节 内含子的剪接,一. 核酶(Ribozyme) 1981年T.Cech和S.Atman等在研究四膜虫rRNA时发现的； T.Cech由核糖核酸（ribonucleic acid）和酶（enzyme）这两个词“重组”成一个新的词： “ Ribozyme”； 是指本质为RNA或以RNA为主含有蛋白质辅基的一类具有催化功能的物质。,核酶和传统酶的区别：,(1)一般的酶是纯的蛋白质，而核酶是RNA或带有蛋白的RNA； (2)核酶既是催化剂又是底物。而酶仅

12、催化反应。,核酶发现的意义,（1）突破了酶的概念. 是一种自体催化； （2）揭示了内含子自我剪接的奥秘；促进了RNA的研究。 （3）为生命的起源和分子进化提供了新的依据。,遗传信息的进化路线可能是：,RNA （DNA 表达） (DNA DNA) (DNA表达) RNA RNA 表达 | | RNA病毒 反转录病毒 EB, HBV DNA病毒,酶组成的进化路线可能是：,纯RNA RNA为主 RNA和 蛋白为主 纯蛋白 蛋白为辅 蛋白并重 RNA为辅 核酶 RNAaseP ？ 端粒酶 一般酶类,生物体组成的进化：,蛋白（朊病毒） RNA RNA+蛋白 RNADNA+蛋白 DNA+蛋白 类病毒 RN

13、A病毒 巨细胞病毒(HCMV) DNA病毒,内含子剪切相关的酶,内含子的发现,1977 美Sharp & Roberts 同时发现了断裂基因(split gene) 法 Chambon 失机 鸡的输卵管分泌卵清蛋白、卵粘蛋白和 伴清蛋白，而其红细胞（鸟类的红细胞 上有核的）只合成血红蛋白，那么两种 组织之间DNA有什么不同呢？ southern杂交 Berget，Sharp小组和Roberts小组用R环法,DNA和mRNA之间形成特殊的RNA-DNA异源双链分子结构,断裂基因 Split Genes,二. 内含子的结构特点,(一) 内含子和外显子的分布 (二) 内含子的相对性,经过删除和连接，

14、除去无关的DNA间序（即内含子），便形成了成熟的mRNA分子,断裂基因 Split Genes,有的内含子可编码内切酶。,三. 内含子的生物学意义,有的内含子可编码内切酶。 成熟酶 (maturase) 归巢 (Homing) 调控 提高进化速率,Homing 归巢,在某些内含子中含有开放续框，可产生具有三种功能的蛋白。这些蛋白可使内含子（或以其原来的DNA形式，或作为RNA的DNA拷贝）移动，使内含子可插到一个新的靶位点，这个现象叫做归巢。,Crick（1978年）提出了一系列问题,（1）剪切若是通过酶，那么这种酶是怎 样识 别RNA上特定的位点？ （2）剪切酶有没有特异性？ （3）切除的R

15、NA是以线状还是环状存在 的？切下的RNA的命运将如何？ （4）内含子有无调控作用？,（二）边界序列,Chambon等发现内含子切割位点有2个特点,（1）内含子的两个末端并不存在同源或互补。 这就排除了存在二级结构的可能。 （2）连接点具有很短的保守序列，称为边界 顺序。其规律称为GT-AG法则（GT-AG rule) 或Chambon法则。 左边的剪接位点称供体（donor）位点， 右边的剪接位点称受体（acceptor）位点。,交界顺序,三 I类内含子的剪接,Cech等1981年用四膜虫分离得到了35S的前体rRNA，它含有一个长413bp的内含子。 此35S rRNA要加入一价或二价阳离

16、子及GTP就可以在体外释放出413b的线性的内含子， 若继续保温，那么线形内含子又可形成环状的RNA。这就意味着35S RNA在GTP的作用下可以自我剪接。,In 1983,Cech& Altman, established the existence of catalytic RNAs,Thomas R. CechUniversity of Colorado USA,1947 -,Sidney AltmanYale University,USA 1939 -,The Nobel Prize in Chemistry 1989 for their discovery of catalytic

17、properties of RNA,重组DNA转化E. coli,(一)I类内含子的结构特点是,1. 其边界序列为5U-G 3； 2. 具有中部核心结构（Central core strucature） 3.内部引导顺序（internal guide seguence IGS）,(二) I类内含子的剪切机制,转酯反应(transesterification) 酯键从一个位置转移到另一个位置。,四. 类内含子的剪接,(一)结构特点 (1) 边界序列为5GUGCGYnAG； (2) 有6个茎环结构； 有分支点顺序（branch-point seguence）,(二)剪接机制,无需鸟苷的辅助，但需镁

18、离子的存在。 分枝点A的2-OH对5端交界处的磷酸二酯键发动亲核进攻，产生了套索（lariat）结构（图13-31）； 切下的外显子1其3-OH继续对内含子3端的交界序列进行亲核进攻，同时释放出套索状的内含子。,五. 核mRNA的剪接,(一) 结构特点： 1. 边界顺序:符合GU-AG法则。 2. 分枝点顺序：为Py80NPy87Pu75APy95其中A为百分之百的保守，且具有2-OH。 3.内含子5端有一保守序列可以和U1 snRNA的5端的保守顺序互补,(二)剪接机制,剪接因子 snRNPs U1,U2,U5和 U4/U6。,剪接与mRNA出核相关联 在完成合成和加工后，mRNA以核蛋白复合体的形式从细胞核内转运到细胞质中。问题是这些蛋白如何识别mRNA?如何确保仅加过工的mRNA被转运？部分答案是：剪接体可能形成于转录完成之前以去除内含子，但剪接和出核前应具有直接连系。 一个9个蛋白质组成的复合体通过剪接体同RNA结合，称为外显子连接复合体（exonjunction complex, EJC）,EJC包含一组称为REF家族的蛋白质（了解得最清楚的成员是Aly）。REF蛋白依次和转运蛋白（称为TAP