上海交通大学-环境微生物-微生物生态1.ppt

1、12.环境微生物生态,王 志 平 ,Microbial ecology in environment,19:25,2,一、生态系统,在一定空间和时间内范围内，生物(动物、植物、微生物的个体、种群、群落)和生存环境(光、土壤、空气、水等生物因子)之间通过物质循环和能量流通组成一个自然体。,19:25,3,1.生态系统的组成,19:25,4,基本概念 1,个体：指某一具体生物的单个个体，具有生长-发育-繁殖-死亡的过程，是组成种群的单位。 种群：是生活在同一特定空间的同一生物种的所有个体的集合体，是生物群落的组成单位。 群落：生活在同一特定空间或区域的所有生物种群的聚合体，是生态系统的组成部分。,

2、19:25,5,食物链(Food chain)：一种生物被另一种生物吞食，后者再被第三种生物吞食，形成以食物连接起来的链锁关系。 食物链对环境中物质的转移和蓄积有重要作用。 营养级(Trophic level):食物链某一环节上的所有生物种的总和。,基本概念 2,19:25,6,生产者(Producer)：利用太阳能或化学能将简单无机物合成复杂有机物的生物。 消费者(Consumer)：靠植物或其他生物为食而获得生存能量的生物。 分解者(Decomposer)：将复杂的有机物分解简单的无机物的生物。,基本概念 3,19:25,7,19:25,8,能量金字塔：能量随营养级由下而上逐级递减，各营养

3、级仅能将约10输送给上一级(能量流动十分之一定率)，由此构成金字塔形结构。 适于水生生态系统,基本概念 4,19:25,9,生物放大(Biomagnification)：在同一食物链上，污染物通过食物链传递使浓度随营养级逐级提高的现象(专指有食物链关系的) 生物浓缩 (Bioconcentration)：从周围环境中蓄积某种元素或难分解的化合物，使生物体内该物质的浓度超过环境中浓度的现象。生物富集(Bio-enrichment) 生物积累:生物体生长发育过程中，通过环境或食物累积污染物的过程。,基本概念 5,寂静的春天 (SILENT SPRING)， DDT,19:25,10,2.生态系统的

4、功能-能量物质循环,能量通过食物链在生态系统中传递和消耗； 物质通过食物链在生态系统中传递转化。,19:25,11,生态系统是开放系统，当能量和物质的输入大于输出时，生物量增加；反之，生物量减少。 正常条件下，系统内各种群的数量比均保持相对恒定。 受到外界干扰时，生态系统能自行调节恢复到原来的稳定状态，即生态平衡(动态平衡)。,生态平衡,19:25,12,1. 互生关系,2. 共生关系,3. 竟争关系,4. 寄生关系,6. 捕食关系,3.微生物生态系统内的生物关系,5. 拮抗关系,19:25,13,两种生物可以独立生活，也可以形成松散的联合，对一方有利，或双方都有利。例如，土壤中纤维素分解细菌

5、和固氮菌、产甲烷菌与产乙酸菌、硫酸盐还原菌与光合细菌之间的互生关系。,互生关系 (Metabiosis),19:25,14,2 CO2 + H2S + 2 H2O,2 CH2O + H2SO4,2CO2 + 4H2S,红硫细菌,2 CH3CHOHCOOH + H2SO4,2 CH3COOH + 2 CO2 + H2S + 2 H2O,乳酸,乙酸,硫酸盐还原细菌,CO2 + 2 H2S,CH2O + 2 S + H2O,绿硫细菌,硫还原细菌,CH3COOH + 4S + 2H2O,硫酸盐还原菌与光合细菌,19:25,15,两种微生物紧密生活在一起，彼此依赖，相互为对方创造有利条件，有的达到了难以

6、分离的程度。生理上相互分工，组织上形成了新的结构，彼此分离各自就不能很好地生活。 在环境微生物领域，纯化分离微生物时经常遇到两种微生物很难被分离的现象，其中有的就是源于共生关系的两株菌；而生物膜、活性污泥菌胶团内的微生物一般也都存在共生关系。,共生关系 (Symbiosis),19:25,16,一种微生物生命活动中，通过竞争营养基质或产生某些代谢产物改变环境条件，能抑制其它微生物的生长繁殖，或毒害杀死其它微生物的现象。 如：活性污泥中，在溶解氧或营养成为限制因子时，菌胶团细菌与丝状细菌的关系；曝气生物滤池中硝化菌与异养菌竞争关系。 由于微生物的世代时间比较短，代谢强度大，所以生存竞争往往表现得

7、很激烈。在一个生存环境内，不同的时间将会出现不同的优势种。这种优势微生物在某种环境下，能最有效地适应当时的环境，而环境条件一旦改变，就可能被另一种微生物代替并发育成新的优势种。,竞争关系 (Competition),19:25,17,活性污泥中的胶团形成菌和丝状菌形成一个微生物共生的生态体系，在这种共生关系中，丝状微生物是一种不可缺的重要微生物，其对于维持污泥絮体的结构稳定，保证活性污泥系统高效稳定地净化污水起着重要的作用。 通常在活性污泥中菌胶团细菌占主导优势时，污泥有着良好的沉降性能；但当丝状菌生长超过菌胶团细菌时，就会出现污泥膨胀，导致污泥的沉降性能变差，出水水质恶化、浑浊。 当活性污泥

8、系统中溶解氧 (DO) 降低时，活性污泥中的微生物将对有限的DO展开竞争，由于丝状菌的表面积比比菌胶团大，有竞争力，造成污泥膨胀。,菌胶团细菌与丝状细菌,19:25,18,一种生物能侵入另一种生物体内吸取自己所需要的营养物质进行生长繁殖，在一定的条件下对后者造成损害或死亡的现象叫寄生。,寄生关系 (Parasitism),细菌间：一种细菌可以寄生在另一种细菌体内。如食菌蛭弧菌能寄生在大肠杆菌等许多-菌体内。,真菌间：一种真菌寄生在另一种真菌间较普遍（食用菌与绿色木霉）。,19:25,19,食菌蛭弧菌,19:25,20,两种微生物生活在一起时，一种微生物产生某些特殊的代谢产物或改变环境条件，从而

9、抑制甚至杀死另一种微生物的现象。 许多微生物在其生命活动过程中，产生抗菌物质(抗菌素和杀菌素)，能抑制对它分泌物敏感的微生物，这是一种特异性拮抗关系。 在酸菜、泡菜和青贮饲料的制作过程中，由于乳酸细菌的旺盛繁殖，产生大量乳酸，使环境变酸而抑制腐败细菌的生长，是一种非特异性拮抗关系。,拮抗关系 (Antagonism),19:25,21,酵母菌与绿藻的拮抗关系,19:25,22,捕食关系是一种微生物直接吞食另一种微生物，如废水生物处理系统中原后生动物捕食细菌、放线菌、真菌的孢子及单细胞藻类；富营养化水体中食藻细菌捕食藻类。,捕食关系 (Predation),19:25,23,4.生态系统的分类,

10、植物生态系统 动物生态系统 人类生态系统 微生物生态系统,水生生态系统 空气生态系统 土壤生态系统,19:25,24,进入环境的污染物经微生物作用发生的物质迁移转化过程，及由此导致的微生物种群结构变化及对环境内其他生物的影响。,环境微生物生态研究的对象,19:25,25,二、土壤微生物生态,土壤的生态条件 土壤中的微生物种类、数量及分布 土壤自净和污染土壤微生物生态 土攘污染和土壤生物修复 土攘中微生物的分离与计数,19:25,26,1.土壤的生态条件,温度： pH： 5.58.5 氧：约为土壤中空气分数的78% 营养：无机盐和有机质 渗透压：G+ 2.02.5G- 0.50.6土 0.30.

11、6,19:25,27,每克土壤的含菌量大体上有一个十倍系列的递减规律； 细菌 (108)放线菌 (107)霉菌 (106)酵母菌 (105)藻类 (104)原生动物 (103)； 主要存在于土壤表层以下30cm内。,2. 土壤中的微生物种类、数量及分布,19:25,28,土壤自净：土壤通过各种物理、生化过程，自动分解污染物使土壤恢复到原有水平的净化过程。 自净能力的大小取决于土壤中微生物的种类、数量和活性及土壤结构、通气状况等理化性质。,3.土壤自净和污染土壤微生物生态,19:25,29,土壤自净机理,物理净化：土壤机械阻留、稀释、挥发等 物理化学净化：带电污染物与土壤胶体上吸附的阴阳离子交换

12、 化学净化：氧化还原、中和、络合、分解、光解等 生物净化：土壤微生物胞外、胞内酶的降解作用，最重要的净化途径,19:25,30,分为重金属污染和有机污染； 改变土壤物理化学性质，破坏土壤生态群落； 污染的特点： 隐蔽性、积累性、滞后性、不可逆性,4.土攘污染和土壤生物修复,19:25,31,原位处理 直接向污染地区接种微生物并提供氧气和营养物质，从而实现污染物生物降解的生物修复工艺。 异位处理 将受污染的土壤，搬动或输送到它处进行的生物修复处理，强调人为控制。 反应器处理,土壤生物修复,19:25,32,五氯酚 Flavobacterium sp. (Hu ZhongCheng. 1994)

13、Phanerochaete soidida (Lamar, R.T. et al. 1994) Pnanarochaete chrysosporium (Kang Guyoung et al. 1994) Trametes verscolor (Logan, B. E. et al. 1994) 氯酚 Rhodotorula glutinis (Katayama. et al. 1994)多环芳烃类 Bacillus sp. Mycobacterium sp. (Maue, G. et al. 1994) Nocardia sp. Sphingomonas sp. Alcaligenes sp

14、. Pseudomonas sp. Flavobacterium sp. Mycobacterium sp. PYR-1 (Kelley, I. et al. 1995)2-硝基甲苯 Pseudomonas sp. JS42 (Haigler, B. E. et al. 1994)蒽醌染料 Bacillus subtilla (Itoh, K. et al. 1993)甲基溴化物 Methylocoocus capsulatus (Oremland, R. S. et al. 1994)氯苯 Pseudomonas sp. (Nishino, S. F. et al. 1994) 多氯联苯(P

15、CB) Pseudomonas sp. Alcaligenes sp. (Dercova, K. et al. 1993),污染物 降解菌 参考文献,19:25,33,石油化合物 Bacteroides sp. Wolinella sp. (Jun, E. H. et al. 1994) Desulfomonas sp. Desulfobacter sp. Desulfococcus sp. Megasphaera sp. Acinetobacter sp. (Kwon, K. K. et al. 1994)n-十六烷 Acinetobacter sp. (Espeche, M. E. 199

16、4)间硝基苯甲酸 Pesudomonas sp. (Nadeau, L. J. 1995)3-羟基丁酸聚合物 Acidovorax facilis (Mergaert, J. et al. 1993)3-羟基戊酸聚合物 Variovorax paradoxus Bacillus sp. Streptomyces sp. Aspergillus fumigatus Penicillium sp. 氯化愈创木酚 Acinetobacter junii (Gonzalez, B. et al. 1993)农药 Rhodococcus sp. B-30 (Behki, R. M. et al. 199

17、4)硫丹 Aspergillus niger (Mukhenee, I. et al. 1994)1,4-二氧六环 Actinomyces CB1190 (Perales, R. E. et al. 1994),污染物 降解菌 参考文献,19:25,34,19:25,35,在含100mL无菌稀释水和玻璃珠的锥形瓶中加入土样10g，振荡10min，制成土壤悬浮液，同时另称一份土样烘干至恒重 (105，8h) 置于干燥器中冷却后称重。 将土壤悬浮液作10倍递减稀释至适当浓度。 取最后3个稀释度，通常细菌取10-410-6，放线菌取10-310-5，霉菌取10-210-4。以平皿倾注法（混菌法）或平

18、板涂布法（刮刀法）接种于合适的培养基，每个稀释度做35个平行。 注：每次吸取悬液时，应在稀释液中反复吹吸35次，使悬液中微生物分布均匀，并避免因管壁吸附而造成误差。,4.土攘中微生物的分离与计数,19:25,36,倾注法待培养基冷凝后，涂布法待接种悬液被培养基吸收后，倒置于温箱适温 (2830) 培养，酵母菌和细菌2d4d，放线菌7d12d，霉菌4d7d。 培养适当时间后，取出平皿，计数平板上出现的菌落。细菌和放线菌选取菌落数为30300/平皿，真菌选菌落数在10100/平皿，片状菌苔占平板表面15以上的平皿应舍去，因为它们抑制了其他菌落的正常发育而造成误差。 计算每克干土含菌数，涂布分离长出

19、的单菌落，须经划线纯化，再转斜面培养后保藏备用。,19:25,37,涂布法,倾注法,19:25,38,三、空气微生物生态,空气的生态条件 空气微生物的种类、数量和分布 空气微生物检测及卫生标准,19:25,39,1. 空气的生态条件,空气中有较强的紫外辐射，具有较干燥，温度变化大，缺乏营养等特点，不利于微生物生长繁殖。 微生物在空气中停留时间的长短由风力、气流和雨、雪等气象条件所决定，但它最终要沉降到土壤、水中、建筑物和植物上。,19:25,40,空气中的微生物是动、植物病害的传播、发酵工业中的污染及工农业产品的霉变的重要根源。,空气中的微生物的数量是大气污染程度的标志之一。,2. 空气微生物

20、的种类、数量和分布,一般室内以1m3空气中细菌总数为500-1000个以上为空气污染指标 室外以1.01035.0103 个为空气污染指标。,19:25,41,沉降平板法(平皿落菌)-测降落细菌数 一般认为5min内落在100mm2培养基上的细菌数相当于10L空气中的细菌总数 撞击平板法 利用吸风机将定量空气快速地撞击到一个或几个转动或不转动的平板培养基表面，然后恒温培养48h计算菌落数。,3. 空气中细菌总数测定,空气的微生物监测通常采用营养琼脂平板计数法。,19:25,42,过滤法 让定量的水或空气通过特殊的微生物收集装置(如微孔滤膜等)，然后将滤膜置于培养基上培养，通过菌落计算水或空气中

21、的数量。,沉降平板法,撞击平板法,19:25,43,薄膜过滤计数法,19:25,44,以细菌总数评价空气的卫生标准（个/m3 ）,301,严重污染,300,轻度污染,150,临界环境,31125,普通空气,30,清洁空气,12,最清洁的空气（有空调）,细菌总数,清洁程度,琼脂平板暴露空气 5 min，37 48hr,4. 空气微生物检测及卫生标准,19:25,45,四、水体微生物生态,水体中的微生物群落 水体自净和污染水体的微生物生态 水体富营养化,19:25,46,1. 水体中的微生物群落,贫营养细菌 (oligotrophic bacteria)：能在115mg C/L低有机质含量的培养基

22、中生长的细菌 兼性贫营养细菌：在富营养培养基中经反复培养后也能适应并生长的贫营养细菌 富营养细菌：能生长在营养物质浓度很高 (10gC/L) 的培养基中的细菌，在贫营养培养基中反复培养后即行死亡。 典型的清水型微生物以自养微生物为主，如硫细菌、铁细菌等，以及含有光合色素的蓝细菌、绿硫细菌和红螺细菌等。,19:25,47,藻类 蓝细菌,嗜纤维菌,假单胞菌 柄杆菌属 生丝微菌,脱硫弧菌 甲烷菌 梭菌属,湖沼带,深水带,底栖带,沿岸带,红螺菌 绿硫细菌,淡水中的微生物分布,19:25,48,海水中的微生物,相关微生物特点 嗜冷：大约90海洋环境的温度都在5以下。 耐盐：海水盐浓度大约为3.5%。 耐

23、压：海洋中水深每增加10米，静水压力递增 1个标准大气压。 海洋微生物的重要性 光合作用：海洋浮游生物的光合作用占总光合 作用量的四分之一； 海洋自净：,19:25,49,近海细菌密度高于大洋，内湾与河口内密度最大； 表层水和水底泥界面处细菌密度高于深层水； 不同类型的底质细菌密度差异悬殊，一般泥质高于沙土; 海水中的细菌以革兰氏阴性杆菌占优势,假单胞属较多; 海底沉积土中则以革兰氏阳性细菌偏多,芽胞杆菌属较多。,海水中的微生物分布,19:25,50,广义：受污染的水体经物理、化学与生物作用，使污染浓度降低，并恢复到污染前的水平； 狭义：指水体中的微生物分解有机污染物而使水体得以净化的过程。,

24、2. 水体自净与污染水体微生物生态,影响水体自净过程的因素主要有：受纳水体的水文条件、 微生物的种类与数量、水温、污染物的组成及浓度等。,19:25,51,当有机物排入河流后，沿着河流方向形成一系列连续的污化带： 多污带，BOD高、微生物少、溶解氧低 -中污带，BOD下降、厌氧兼性微生物增多 -中污带， BOD低、溶解氧升高、原后生动物多 寡污带， BOD很低、溶解氧恢复、水生植物、藻,污染带的划分,19:25,52,水体自净指标：P/H指数 P代表光合自养型微生物，H代表异养型微生物，两者的比即P/H指数。 氧浓度昼夜变化幅度,水体自净指标,19:25,53,BIP指数：100*B/(A+B

25、)，A为含叶绿素生物，B为无叶绿素生物。 (8/20/60) 细菌菌落总数(CFU):1ml水样在营养琼脂培养基中，于37培养24h后所生长出来的细菌菌落总数。 总大肠菌群:一群好氧和兼性厌氧、革兰氏阴性、无芽孢的杆状细菌，并在乳糖培养基中，经37 24-48h培养能产酸产气的微生物，是指示水体被粪便污染的一个指标。,水体有机污染指标,19:25,54,制作伊红美蓝培养基； 用灭过菌的锥形瓶盛取河水或沟水，按1:10稀释； 取0.1mL稀释液接种于伊红美蓝培养基上，用平板划线分离法进行分离； 将划线后的培养皿倒置37温箱中培养18h24h，培养基中出现的大肠杆菌菌落中心呈暗蓝黑色，金属光泽；

26、将菌落接种于斜面培养基上(由营养琼脂培养基制)。,从饮水中分离大肠杆菌,19:25,55,我国不同水体中总大肠菌群及粪大肠菌群的标准,三级 5000个/L,二级 1000个/L,一级 500个/L,医院 排放污水,0个/100mL,0个/100mL,饮用水, 18个/L,游泳池水, 40 000个/L,级, 20 000个/L,级, 10 000个/L,级, 2 000个/L,级, 200个/L,级,地表水,粪大肠菌群,总大肠菌群,样品,19:25,56,3. 水体富营养化,在人类活动的影响下，生物所需要的氮、磷等营养物质大量进入湖泊、河口、海湾等缓流水体，引起藻类及其它浮游生物过度增繁，水体

27、溶解氧含量下降，水质恶化，鱼类及其它生物产生变异现象，称为水体富营养化。 水体中的藻类本来以硅藻和绿藻为主，蓝藻的大量出现是富营养化的征兆，随着富营养化的发展，最后变为蓝藻为主。,19:25,57, 1.5,营养状态,总磷/mg L-1,无机氮/ mg L-1,极贫营养, 0.005, 0.2,贫-中营养,0.0050.01,0.200.40,中营养,0.010.03,0.30.65,中-富营养,0.030.1,0.51.5,富营养, 0.1,水体富营养化指标,19:25,58,评价水体富营养化的方法与AGP,评价水体富营养化的方法是： 观察蓝藻等指示生物； 测定生物的现存量； 测定原初生产力

28、； 测定透明度； 测定氮和磷等导致富营养化的物质。 特定藻类接种到天然水体或废水中，在一定光照和温度下培养，至其增长到稳定期，测干重或细胞数即可得其增长量，此即藻类的潜在生产力(AGP)。,19:25,59,藻类迅速繁衍 水质污浊发臭 透明度下降 感观性状恶化 水中溶解氧不足 鱼类及其他生物大量死亡,富营养化引起的水质变化,19:25,60,我国湖泊(水库)富营养化趋势,例如：云南滇池在80年代初期还处于三类水体，90年代后期全湖范围已急剧恶化到劣五类水体，陷入重富营养状态。 按照上述急剧恶化趋势分析：我国本世纪前十年内不仅是湖泊富营养化面积进一步增加，可能将出现全国大范围的富营养化灾害。,1

29、9:25,61,滇池水华,19:25,62,裸藻生长在有机物丰富的静止水体或缓慢的流水中，在25繁殖最快，大量繁殖时形成绿色、红色或褐色的水华（水花），是水体富营养化的指示生物。,19:25,63,赤潮发生频率,1984年以后赤潮频率加快、次数增多 1998年发生赤潮频率最高，达22次 赤潮发生的范围扩大，持续的时间延长 在我国腹泻性、神经性、麻痹性藻类均存在 陆源排放氮、磷、有机物引起近岸水域富营养污染，是赤潮发生的物质基础。,赤潮发生统计,74,173,47,18,4,0,50,100,150,200,94-98年,89-93年,84-88年,79-83年,74-78年,次,19:25,6

30、4,2002年，浙江省近岸海域海水富营养化程度位于全国沿 海省（市、自治区）的第二位，基本无一类海水。 清洁和较清洁海域面积为 1610平方公里； 轻度富营养化海域面积为 4246平方公里； 中度富营养化海域面积为 7781平方公里； 严重富营养化海域面积为17263平方公里。 中度富营养化和严重富营养化海域面积占81%，且严重 富营养化海域面积已超过全省近岸海域面积的一半。,19:25,65,赤潮破坏了海洋的正常生态结构，也破坏了海洋中的正常生产过程，从而威胁海洋生物的生存； 一些赤潮生物会分泌出粘液，粘在鱼、虾、贝等生物的鳃上，妨碍呼吸，导致窒息死亡； 大量赤潮生物死亡后，在尸骸的分解过程

31、中要大量消耗海水中的溶解氧，造成缺氧环境，引起虾、贝类的大量死亡； 有些赤潮生物分泌赤潮毒素，当鱼、贝类处于有毒赤潮区域内，摄食这些有毒生物，并在体内积累，其含量大大超过食用时人体可接受的水平。如果不慎食用，就引起人体中毒，严重时可导致死亡。,赤潮的危害,19:25,66,产毒藻种,Microcystis aeruginosa,Microcystis viridis,Microcystis wesenbergii,铜绿微囊藻,绿色微囊藻,惠氏微囊藻,19:25,67,Anabaena,Oscillatoria,Nostoc,鱼腥藻,颤藻,念珠藻,产毒藻种,19:25,68,饮用水中的微囊藻毒素

32、,淡水中常见的蓝藻能产生肝毒素和神经毒素，直接关系到供水安全。 大部分肝毒素是微囊藻毒素 (microcystins)，已知70多种亚型的微囊藻毒素，微囊藻毒素LR是最早被鉴定出来也是最常见的亚型。 神经毒素在供水系统中不 像肝毒素那样分布广泛，造 成的危害程度也较微囊藻毒 素低。,Microcystins, MC,微生物群落结构和多样性是微生物生态学研究的热点内容 群落结构决定了生态功能的特性和强弱； 群落结构的高稳定性是实现生态功能的重要因素； 群落结构变化是标记环境变化的重要方面。,19:25,69,五、微生物多样性,通过对微生物群落结构和多样性进行解析并研究其动态变化，可以为调节群落功

33、能和发现新的重要微生物功能类群提供可靠的依据。,传统培养分离方法：依靠形态学、培养特征、生理生化特性的比较进行分类鉴定 微生物化学成分分析：脂肪酸、呼吸醌。 以DNA为代表的现代分子生物学方法,19:25,70,微生物群落研究方法,通过rRNA基因测序技术和基因指纹图谱等方法，比较精确地揭示了微生物种类和遗传的多样性，并给出了关于群落结构的直观信息。,有利于整理相关的生物知识，分类越细，系统信息越丰富，参考意义越大； 可以对相似微生物的知识作进一步的推测和假设； 是进行微生物群落结构和多样性分析的前提。,19:25,71,1. 微生物分类,19:25,72,分类原则,对生物进行分类存在两种基本

34、的、截然不同的分类原则： 一是根据表型(phenetic)特征的相似程度分群归类，这种表型分类重在应用，不涉及生物进化或不以反映生物亲缘关系为目标； 第二种分类原则是要按照生物系统发育相关性水平来分群归类，其目标是探寻各种生物之间的进化关系，建立反映生物系统发育的分类系统。,根据形态学特征推断生物之间的亲缘关系存在两个突出问题： 一是由于微生物可利用的形态特征少，很难把所有生物放在同一水平上进行比较； 二是形态特征在不同类群中进化速度差异很大，仅根据形态推断进化关系往往不准确。,19:25,73,表型分类存在的问题,以进化论为指导思想的分类学(taxonomy)，其目的已经不仅仅是物种的识别和

35、归类，其主要目标是通过研究和比较微生物乃至整个生物界的基因型特征来追溯系统发育、探讨生物的进化谱系并进行分类鉴定。这样的分类学即称之为生物系统学(syatematics)。 必需从蛋白质、RNA、DNA这类能反映微生物遗传特性的基因组特征生物大分子结构入手，建立判断微生物进化谱系的指征。,19:25,74,系统分类的提出,必须普遍存在于所研究的各个生物类群中； 必须为功能同源的生物大分子； 该生物大分子序列必须严格线性排列，以便于鉴定其同源位置或同源区； 根据所比较的各类生物之间的进化距离来选择适当的分子序列。,19:25,75,最终确定最适合揭示生物亲缘关系的是rRNA,分类指征的要求,rR

36、NA参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中，其功能保持不变； 在16S rRNA分子中，即含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究； 16S rRNA相对分子质量约为1540bp，大小适中，量大便于提取并进行序列分析； 16S rRNA普遍存在于真核生物和原核生物中（真核生物中其同源分子是18S rRNA）。,19:25,76,rRNA作为进化指征的优点,16SrRNA和16SrDNA的区别：16S中的“S”是一个沉降系数，亦即反映生物大分子在离心场中向下沉降速度的一个指标，值越高，说

37、明分子越大。 rDNA 和rRNA中的小写字母“r”是ribosome(核糖体)的缩写。 rDNA指的是基因组中编码核糖体RNA（rRNA）分子的对应的DNA序列，也就是编码16S rRNA的基因。 rRNA指的是rDNA的转录产物，它是构成核糖体的重要成分，核糖体由许多小的rRNA分子组装而成。,19:25,77,2. 微生物16SrRNA结构,细菌核糖体的RNA含有3种类型，即23S rRNA、16 S rRNA和5S rRNA，它们含有的核苷酸分别约为2900个，1 540个和120个。20世纪60年代末，Woese等学者开始采用寡核苷酸编目法对生物进行分类，他通过比较各类生物细胞的rR

38、NA特征序列，认为16 s rRNA及其类似的rRNA基因序列作为生物系统发育指标最为合适。 其主要依据为，它们为细胞所共有，其功能同源且最为古老，既含有保守序列又含可变序列，分子大小适合操作，它的序列变化与进化距离相适应。,19:25,78,19:25,79,其序列包含10 个可变区（variable region）和11 个保守区（constant region），其中V1、V2、V3和V4共4个高变区，尤其是V2这一高变区，由于其进化速度相对较快，其中所包含的信息，足够用于物种属及属以上分类单位的比较分析。因此，Johes S W和Neller H F等报道测定16 S rRNA基因的部

39、分序列即可达到鉴定的目的。,19:25,80,19:25,81,16S rRNA PCR 引物及位置,16S rRNA 的同源性分析最适用于属及属以上的远缘关系。目前, 已对10000 种( 约相当于50%) 以上的真细菌的16s rRNA 进行了测序, 不同菌属的16s rRNA 序列同源性为70% 95%。 16S rRNA 序列和DNA-DNA 同源性相关关系的研究表明: 序列的相性不在99. 8%以上就不能达到70%以上DNA-DNA 的同源性。 16S rRNA 总共约有1500bp, 0. 2%的不同相当于3 个碱基。 由于数据库中的数据不一定完全而且个人读取数据也可能出现错读,

40、因此由16s rRNA 序列鉴定种是很难的。,19:25,82,第一，由于16S rDNA具有高度保守性，且分子小、包含的信息量较少，对于亲缘关系较近的细菌，其分辨率不高。 第二，16 S rDNA序列分析只能在属的水平上区分细菌，而在水平分类这个环节上仍然需要借助其他手段加以辅助分析。,19:25,83,基于16S rRNA分类的局限,虽然说细菌的基因组的大小和基因段是千差万别，但是无论多么小，它们必须包含有所有的信息去允许细菌去执行多种必要的功能，给予细胞维持内部的代谢平衡的能力，复制和进化，这三种主要的活细胞的功能。 细胞经常能够吸收代谢物但其不是功能蛋白，因此，它们必须去依赖它们自有的

41、基因产物去执行必要的功能。,19:25,84,核心基因,信息的存储和加工 DNA的代谢：基本的复制功能，DNA的修复、限制和修饰 RNA的代谢：基本的转运功能，翻译，RNA的降解 蛋白质的加工、折叠、分泌 细胞的结构和细胞壁的加工 活跃且处于中间的代谢,19:25,85,常规核心基因,rpoB(核糖核酸聚合酶):是在所有的生物体内在转录以及最终的目标是控制基因表达的调控路径;其可变区域位于2300bp到3300bp之间，大小约为680bp。 gyrB(DNA促旋酶),是普遍存在于细菌内编码DNA促旋酶中B亚单位蛋白的基因，在DNA复制及DNA超螺旋结构的维持过程中起着重要的作用;基因序列全长约

42、为1.2-1.4 kb，平均碱基替换率为每100万年变化0.70.8 ，比16SrDNA的每5000万年变化1的速度快。由于其作为蛋白编码基因，其所固有的遗传密码子的兼并性使得DNA序列可以发生较多的变异而不改变氨基酸序列，尤其是密码子的第3位碱基 ，这就使得gyrB基因序列在区分和鉴定细菌近缘种方面，比非蛋白编码基因16 S rDNA具有更高的分辨率。,19:25,86,sodA基因, 其具有锰的金属依赖性依赖。超氧化物歧化酶歧化酶（编码超氧化物歧化酶, 超氧化物歧化酶可以催化超氧阴离子的歧化反应产生氧分子和过氧化氢，大小约为435bp。 groEL:编码一种热休克蛋白60Kda，757bp

43、。 recN:编码一个重组修复蛋白.,19:25,87,在不同种的细菌类型中，16S rRNA的基因序列的相似性是88.8%到99.7%之间，sodA基因的序列相似性是63.6%到100%，ropB序列的相似性是在76.1%到97.6%之间。gyrB基因序列的相似性是在64.6%到97.5 %之间，groEL的序列相似性是在72.6%到96.6%，recN基因序列的相似性是从56.4%到98.2%之间 16S rRNA序列相似性在两种亚种之间是从97.6%到99.9%。sodA基因的序列相似性是88%到98.9%，ropB序列的相似性是在97.95到99.6%之间。gyrB基因序列的相似性是在

44、93.7%到98.5%之间，groEL的序列相似性是在93.9 %到98.8%。recN基因序列的相似性是从98%到89.8%之间.,19:25,88,通过采用反转录酶和双脱氧序列分析，可以对未经纯化的rRNA抽提物进行直接的rRNA全序列测定。 据此，目前已知的微生物种大约有15万种。,19:25,89,在双链DNA中A与T配对，而G与C配对，因此DNA中的(G + C)/(A + T)比值或G+C含量(G+C content) ， G + C百分比较好地反映了碱基序列 双链DNA中GC有3个氢键、AT有2个氢键連接，故当DNA含高G+C含量时，其含有较多氢键，需要在更高的溫度下才能解链，因

45、而其熔点较高.,19:25,90,核酸碱基组成,Tm的測定，当有50%双链DNA分解成单链时的温度,在260 nm紫外光吸光度随着DNA 双链解开而升高 当缓慢加热DNA样品时，吸光度随氢键分解而增加，该上升曲线的中间点即为解链温度 直接測定G+C含量 DNA的密度隨G+C含量直線增加，以CsCl2密度梯度離心即可得知 動物和高等植物DNA之G+C含量平均約為40%，介於30%至50%之間； 真核和原核微生物DNA之G+C含量變異很大； 原核生物G+C含量約25%至80%之間。,两种微生物G+C含量差异大于10%，代表它们的基因组有较大的碱基序列差异； G+C含量非常相似的生物，其DNA碱基序

46、列也可能差异很大 只有在兩种微生物表型也相似，才能認為它們相似，显示它们亲缘关系密切 微生物的分类上，同属若G+C含量差异太远，则该分类单元可能需要再划分 不同属间G+C含量差异可能会非常大，但同属內的变化量常小于 10%，而同种内应小于5%,现代细菌分类学中，DNA-DNA分子杂交一直认为是作为细菌种水平上分类和鉴定的“黄金法则”。,基本原理：使用DNA解链的可逆性和碱基配对的专一性，将不同来源的DNA在体外变性（高温或pH)，并在合适的条件下(盐类浓度和温度），使互补的碱基重新配对，测量杂交百分数(常以同源%表示；也有称碱基相似性%）百分数越高，杂交的两种DNA之间碱基线性序列的相似性就越

47、高，说明它们之间的亲缘关系也就越近。,常见的几种方法：（1）标记法 （2）吸光度法 （3）荧光强度法等,DNA-DNA杂交,核酸杂交目前常采用固相杂交法，将待测菌株双链核酸解成单链固定在硝酸纤维素滤膜等固相支持物上，置入含有经标记的并解链的参照菌株的单链核酸(探针)液中复性，形成新的双链核酸，测定杂合双链的相对放射性强度来确定菌株问的同源性程度。,计算公式：,一般认为核酸杂交同源性70为同一亚种。,19:25,98,分类是认识客观事物的一种基本方法。我们要认识、研究和利用各种微生物资源也必须对他们进行分类。 分类学内容涉及三个相互依存又有区别的组成部分：分类、命名和鉴定。,3.基于16SrRN

48、A的微生物分类,分类（classification）是根据一定的原则（表型特征相似性或系统发育相关性）对微生物进行分群归类，根据相似性或相关性水平排列成系统，并对各个分类群的特征进行描述，以便考察和对未被分类的微生物进行鉴定； 命名（nomenclature）是根据命名法规，给每一个分类群一个专有的名称； 鉴定（identification或determination）则是指借助于现有的微生物分类系统，通过特征测定，确定未知的、新发现的或未明确分类地位的微生物所应归属分类群的过程。,19:25,99,19:25,100,界Kingdom 门Phylum亚门 纲Class亚纲 目Order亚目

49、科Family亚科 属Genus 种Species,分类单元及其等级,19:25,101,菌株（strain),从自然界分离得到的任何一种微生物的纯培养物都可以称为微生物的一个菌株；用实验方法（如通过诱变）所获得的某一菌株的变异型，也可以称为一个新的菌株，以便与原来的菌株相区别。 型（form或type),常指亚种以下的细分，当同种或同亚种不同菌株之间的性状差异，不足以分为新的亚种时，可以细分为不同的型。 种（species),是生物分类中最基本的分类单元和分类等级，原核生物的種是有許多共同穩定特徵而與他類菌株有顯著區別的菌株集合。,这个“种”的定义非常主觀 更精確的定義应该是：一個種(基因型

50、種)是有相似G +C組成和有70%或以上之DNA雜交實驗判定之集合 由於基因體序列之數據增加，種或許可以定義為具有相同序列 種可能是生物其主要保守基因housekeeping gene(所有細胞皆需之基因，其通常持續表達)具有相同序列之集合 菌株(strain)，在一個特定分類學中至少與其他一些群體可以區別之生物群體，为单一生物.,19:25,102,一個種內其菌株間在許多方面上可能有小差異 變種(biovars) 是生化或生理上有差異之各色各樣的原核菌株 形態變種(morphovars)是指形態上不同 血清變種 (serovars)則指具有獨特抗原特性 模式菌株(type strain) 通

51、常是首先被研究的菌株，其特徵比其他菌株瞭解得多，它不 一定是最具代表性的菌株 模式種 (type species) 種的模式菌株：是命名的模版或擁有種名的菌株 每一個種都屬於一個屬(genus) ，將種置於一個屬有相當主觀，有些分類學家也許不同意屬的組成,19:25,104,分级树举例,由于细菌分类单元的划分缺乏一个易于操作的统一标准，为了减少因采用不同标准界定分类单元所造成的混乱， 细菌系统分类也像其他生物分类一样采用“模式概念”。即根据命名法规要求，正式命名的分类单元应指定一个命名模式（简称模式）作为该分类单元命名的依据。,19:25,105,微生物的命名,19:25,106,属名 属名用

52、一个单数主格名词或当作名词用的形容词来表示，可以是阳性、阴性或中性，首字母要大写。 种名 和其他生物一样，细菌的种名也用双名法（binomial nomenclature）命名，即种的学名由属名和种名加词两部分组合而成。 亚种名 亚种名为三元式组合，即由属名、种名加词和亚种名加词构成。,微生物學家採用雙名系統(binomial system)命名微生物 由瑞典植物學家Carl von Linne所提 系統為拉丁 化，斜體名稱分為兩部分 第一个单词首字母大写是属名，第二個首字母小写是种名，如Escherichia coli； 种名常代表特定性质，是稳定的，某一特定生物最早的特定性质有优先权； 若

53、由于新的信息把某一生物分到另一属中，而需要改变属名，如根据 rRNA分析和其他特征，链球菌属(Streptococcus)分为 2个新属，肠道球菌属(Enterococcus)和乳酸球菌属 (Lactococcus)，粪链球菌(Streptococcus faecalis)现更名为粪肠球菌(Enterococcus faecalis) 属名常被缩写为首字母大写表示，例如E. coli，文章中第二次出現菌名才可缩写，第一次出現时要全名。,传统的微生物培养法 群落水平生理学指纹方法(CLPP) 生物标记物法（Biomakers ） ERIC-PCR指纹图谱技术 基于rRNA及rDNA的分析方法,1

54、9:25,108,4. 基于16SrRNA的群落结构和多样性分析方法,19:25,109,基于rRNA及rDNA的分析方法,19:25,110,19:25,111,19:25,112,19:25,113,在研究生物进化和系统分类中，常用一种树状分枝的图型来概括各种（类）生物之间的亲缘关系，这种树状分枝的图型被称为系统发育树(phylogenetic tree)，简称系统树。 图型中分枝末端和分枝的连接点称为结(node)，代表生物类群，分枝末端的结代表仍生存的种类。 系统树可能有时间比例，或者用两个结之间的分枝长度变化来表示分子序列的差异数值。 树可以是无根或有根,有根的提供一个节点代表共同祖

55、先，无根的仅表示系统发育关系。,19:25,114,5. 系统发育树,構建滿意的演化樹的最大困難之一為基因廣泛而頻繁發生水平或橫向轉移 真核生物擁有來自細菌和古生菌的基因 兩個原核生物域之間有著頻繁的基因交換 此種基因移動係來自病毒媒介的轉移 因此微生物進化的模型並不像先前認為是線性或樹狀 更實際的網狀樹 域內基因轉移比域間多，這3個域保持獨立分開 常從16S rRNA序列所得的樹，因這些數據極其廣泛，大多數微生物學家採用,蛋白質序列製作系統發育樹優點 20種胺基酸 構成之系列比由4種核苷酸構成的序列在每個點上有更多信息 蛋白質序列比DNA和RNA序列較少受物 種特異之G+C含量差異的影響 蛋白質序列排列較容易，因它不像rRNA序列那樣視二級結構而定 不是所有蛋白質都適合於研究發生在長時期 大尺度的改變 組蛋白和熱激蛋