《荧光分析法》PPT课件.ppt

1、荧光分析法（fluorescence),荧光棒发光原理 荧光棒中的化学物质主要由三种物质组成：过氧化物、酯类化合物和荧光染料。简单地说，荧光棒发光的原理就是过氧化物和酯类化合物发生反应，将反应后的能量传递给荧光染料，再由染料发出荧光。目前市场上常见的荧光棒中通常放置了一个玻璃管夹层，夹层内外隔离了过氧化物和酯类化合物，经过揉搓，两种化合物反应使得荧光染料发光。,荧光分析法,荧光：物质分子接受光子能量被激发后，从第一激发单重态的最低振动能级返回基态时发射出的光。,优点：灵敏度高；选择性好；试样量少；方法简单。,缺点：应用范围小。,荧光分析法：根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的

2、方法。,第一节 荧光分析法的基本原理,一、分子荧光,（一）分子荧光的产生,单重态：s=0，M=1，分子所处的电子能态。,分子的多重性：,总自旋量子数：,三重态：s=1，M=3，分子所处的电子能态。,1.分子的电子能级与激发过程,电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通 过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量。,2.荧光的产生,非辐射能量传递过程,振动弛豫(vibrational relexation)：出于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞而将部分振动能量传递给溶剂分子，其电子返回到同一电子能级的最低振动能级间的过程；发生振动弛豫的时间10 -12s。 内部能量转换(inter

3、nal conversion)：当两个电子激发态之间的能量相差较小以致其振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子能级的过程。,外部能量转换 （external conversion)：激发态分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而失去能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。 体系间跨越(intersystem crossing)：处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程；分子由激发单重态跨越到激发三重态。,非辐射能量传递过程,辐射能量传递过程,荧光发射：激发分子从第一激发单重态的最低振动能级跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐射称为荧光；

4、荧光辐射能要比激发能量低，荧光波长大于激发波长；荧光发射时间为10-9-10-7s。,磷光发射：激发分子由第一激发三重态的最低振动能级跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐射称为磷光；磷光辐射能要比荧光辐射能量低，磷光波长大于荧光波长；磷光发射时间为10-4-10s。,荧光分光光度计的主要部件：光源、激发单色器、发射单色器、样品池、检测系统。,SK-2003A型荧光光谱仪(国内首创）,RF-5400荧光光度计,Hitachi(日立)F-2500荧光分光光度,荧光分光光度计澳大利亚,（二）荧光的激发光谱和发射光谱,激发光谱（excitation spectrum）：将激发光的光源用激发单色器分光，

5、使不同波长的入射光激发荧光体，然后让所产生的荧光通过固定波长的发射单色器而照到检测器上，测定不同波长光照射下荧光强度的变化，以激发波长为横坐标，荧光强度为纵坐标，可得荧光物质的激发光谱。,注意：激发光谱与其吸收光谱极为相似，但激发光谱曲线是荧光强度与波长的关系曲线，吸收曲线则是吸光度与波长的关系曲线，两者性质是不同的。,荧光光谱（fluorecence spectrum）：固定激发光波长为最大激发波长，而让荧光物质发射的荧光通过发射单色器分光扫描并检测不同波长下的荧光强度，以发射波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，得到物质的荧光光谱。 荧光物质的最大激发波长（ex）和最大发射波长（em）是鉴定

6、物质的根据；也是定量测定最为灵敏的条件。,荧光光谱的普遍特性,1.斯托克斯位移(Stokes shift):,激发光谱与发射光谱之间的波长差值；荧光发射波长总是大于激发光谱波长。,室温下菲的乙醇溶液荧光光谱,2.荧光光谱的形状与激发波长无关,电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，从而荧光发射光谱只有一个发射带，而且荧光光谱的形状与激发波长无关。,3.荧光光谱与激发光谱的镜像关系,荧光光谱的普遍特性,激发光谱与荧光光谱成对称镜像关系。,蒽的激发光谱（虚线） 荧光光谱（实线）,蒽的能级跃迁,荧光猝灭：荧光物质分子与溶剂分子

7、或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭。 荧光熄灭剂：能引起荧光强度降低的物质。,4.荧光熄灭剂,荧光熄灭法: 荧光物质加入某些猝灭剂后，其荧 光强度的减少与荧光猝灭剂的浓度呈线性关系，可用于测定猝灭剂的含量，这种方法称为荧光熄灭法。,（二）有机化合物分子结构与荧光的关系,物质产生荧光必须具备的条件： （1）物质的分子必须具有能够吸收紫外和较短波长可见光的结构; （2）只有那些具有 p- p共轭双键的分子才能发射较强的荧光.,二、荧光与分子结构,1.长共轭结构（芳香族化合物） 共轭度越大，荧光效率越大，荧光波长长移,2.分子的刚性,分子刚性越强，分子振动少，与其它分子碰撞失

8、活的机率下降，荧光量子效率提高，荧光长移。,3.取代基对分子发射荧光的影响,（苯环上）取代 给电子基团，使 共轭程度升高。荧光强度增加：如CH3，NH2 ，OH ，OR等。 (苯环上）取代吸电子基团时，荧光强度减弱甚至熄灭：如： ，COOH ，CHO， NO2 ，N=N。 高原子序数原子，增加体系间跨越的发生，使荧光减弱甚至熄灭。如：Br，I 。,1.分子荧光分析中，含有重原子如碘、溴的分子易发生： ( ) A 振动弛豫 B 内部转换 C 体系间跨跃 D 荧光发射 答案：C 2.在下列的四种说法中，哪一种是不正确的（） A分子荧光发射光谱通常与吸收光谱互为镜像关系； B分子荧光发射光谱形状与激发波长没有关系； C分子