高效液相色谱的维护与保养

1、高效液相色谱的维护与保养,液相色谱仪器的使用及保养,色谱泵的保养,流动相要过滤 常用缓冲液时，停泵前要用水冲洗，并用水冲洗柱塞杆清洗孔 拧紧排液阀时，不要太用力，以不渗液为准 更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性,如不互溶，要用一种中间溶剂过渡. 例如:使用无机盐缓冲液时,用前和用后均须用水过渡,流动相的脱气,流动相脱气的目的 使色谱泵的输液准确 输液均匀准确，并且脉动减小 保留时间及色谱峰面积的重现性提高 提高检测的性能 防止气泡引起的尖峰 基线稳定，信噪比增加 溶剂的紫外吸收本底降低 保护色谱柱 减少死体积 防止填料的氧化,流动相脱气的方法,加热 简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容

2、易造成流动相组成的变化 抽真空 同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果 超声波 简单，但效果不理想。 通惰性气体（一般用氦气） 可保持连续脱气，多用于低压梯度 在线脱气机 可保持连续脱气，多用于低压梯度,色谱泵的排气操作,使用前，应先确认泵头内没有气体，如有气体要按以下步骤排气： 将排液阀反时针转2-3圈，用10ml注射器抽，直到出液 按以下方法之一将泵的后面放空 将U6K的C阀打开，或717设在PURGE状态 或，将参比阀打开 或，把色谱柱摘下 打开电源开关 开大流速到 69ml/min 同时用10ml注射器从排液阀注入流动相 直到泵后的流速稳定无气泡为止,色谱泵的运行,注意用外部控制器

3、与用泵面板控制的区别 有些型号的外部控制器与面板不能同时用 如需要面板控制，需要断开控制线或关闭控制器 排气后的色谱泵即可运行 注意 排气后，先设流速为 0 恢复排气时断开的部分，如进样器、色谱柱 如需要，恢复排气时断开的控制线 根据色谱柱的不同，逐渐提高流速到设定值,液相色谱对流动相的要求,除色谱柱对流动相的要求外，还有 与检测器匹配 脱气 避免卤素离子（不锈钢系统） 溶剂的粘度 防止细菌的生长,流动相的保存,有机溶剂流动相: 室温下密封,避光保存 缓冲盐流动相: 当日现配现用 低温下密封保存,一般不超过3天 防止长菌 有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相: 低温密封保存 防止有机相的挥发 选

4、用适宜的容器,分,保存于聚乙烯瓶中的超纯水,测试条件 水样: 40ml trace enrichment 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水 100% 乙腈 波长: 254 nm,保存于标准棕色玻璃瓶中的超纯水,测试条件 水样: 40ml trace enrichment 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水 100% 乙腈 波长: 254 nm,检测器的保养,如长时间不用检测器可以关掉紫外灯 在4小时以上不用时，太频繁开关也不好 不要让缓冲液长期停滞在检测池内 用纯水冲洗 示差检

5、测器及荧光检测器 注意流动池的耐压，不要在后面加压,关于自动进样器的针清洗,Purge Injector 与 Needle Wash 洗针溶剂瓶(绿色塑料管)不要放在717plus的上部，应放于717plus同一水平面 洗针溶剂根据流动相的不同应有不同：,异丙醇？,液相色谱系统的清洗与钝化,一般采用30磷酸作为清洗剂，用6M硝酸作为钝化剂，先清洗再钝化 清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的污垢 钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成光滑均匀的氧化膜,高效液相色谱的维护与保养,色谱柱的使用及保养,测柱效 良好的色谱实验习惯,拿到一根新色谱柱时，先测柱效 保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录色谱测试

6、条件 定期检测柱效 定期检测仪器的谱带展宽,测柱效的方法,色谱柱种类繁多,性能各异,测定方法亦各不相同 Waters的色谱柱均附有Use and Care说明书,可按说明书所述方法测定 以下是Waters反相C18柱的测定方法: 流动相:乙腈/水=60:40;流速:1ml/min 样品:50mg Acenaphthene(二氢苊)溶于100ml乙腈,加入600l丙酮 进样量5l 检测波长:254nm,计算色谱柱的柱效 N,理论塔板数计算公式： Ws 方法 Wtan16切线法 Wh5.54半峰高 W3s9 3s W4s16 4s W5s25 5s,色谱柱的正确使用及操作,流动相的转换 特别是GP

7、C柱 流速(压力)的变化幅度：0.1ml/min 凝胶柱（GPC及糖柱） 温度的变化幅度 专用色谱柱样品及溶剂的要求,色谱柱与仪器的联接,不同公司的色谱柱接头不同。处理不当时会造成严重后果： 色谱峰展宽（死体积）致使柱效下降或渗漏 解决办法： 自制相应的转换接头 使用“通用”型接头（锥箍及螺母） 这种锥箍在不锈钢管上是活动的，即stop-depth长度可调。因此可以换接不同的色谱系统及色谱柱。从Waters Phase Separations公司能得到一些PEEK工程塑料的接头,可用在各种类型的色谱柱上。,色谱柱的联接,各种锥箍和管路接头长度示意图:,谱带展宽,连接适当,连接不妥,由于色谱柱连

8、接不当引起的谱带展宽，机械问题,色谱柱安装及连接的机械因素,连接不妥，造成漏液,色谱柱的在线保护装置,给色谱柱提供物理的保护 除去样品及流动相中的颗粒 给色谱柱提供化学的保护 防止分析柱被化学污染 装置 在线过滤器 自装填料保护柱 预装保护柱,在线过滤器,In-Line Filter，部件号 WAT084560 防止颗粒在色谱柱头累积 优点：基本不影响柱效 在需要高柱效的分析时中常用（如：氨基酸分析） 可更换的消耗品 更换滤芯，部件号 WAT005139 (5/pkgs) 更换垫圈，部件号 WAT084567 (10/pkgs),保护柱,可避免化学污染 新型保护柱可提高整个色谱柱的柱效，甚至可

9、作为色谱柱使用 保护柱选择： 选用与色谱柱相同的填料 真正起到保护作用 保证色谱分离结果,使用保护柱延长色谱寿命实例：磺胺药物分析,相同保护柱与色谱柱：第950次进样,更换新Sentry Guard保护柱：第951次进样,使用配Symmetry C8保护柱的色谱柱：首次进样,色谱柱的保护,色谱柱的清洗,对所做的样品要有充分的了解 用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗 硅胶柱的一般方法 先用甲醇洗去极性杂质 用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次活化 键合相柱(烷基)的一般方法 20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗 若使用缓冲液，需先用不含盐的水溶液清洗,色谱柱的存放,存放前的处理 除去杂质、缓冲盐 合适的存放溶剂 避免色谱柱床的干涸 避免机械震动 防止细菌生长 注意存放的温度,正确使用色谱柱（一）,流动相方面 除去微粒 纯度的要求 超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内 缓冲液（盐）的浓度 溶剂：