《分子生物学》教学课件：07 原核调控

1、第七章 原核生物基因表达的调控,主要内容,转录水平的调控 调节基因和结构基因:生物活性相关的基因组织在一起,就不必逐个进行调控,而是一开俱开,一关全关,同时还保持基因产物在比例上大体相当.原核生物的操纵元系统是这种最有效和最经济原则的体现. 转录后调控 翻译水平的调控,第一节 概念,基因表达就是指储存遗传信息的基因经过转录、翻译合成特定蛋白质，进而发挥其生物功能的整个过程。也即基因转录及翻译的过程。 在生命活动过程中并非所有基因都表达，而是有些基因进行表达，形成其基因表达的特异产物，以构成细胞结构或代谢所需要的蛋白质或酶类。但是，有许多基因却被关闭，不进行表达，而要在适当的时候才进行表达。对这

2、个过程的调节就称为基因表达调控 。,组成性表达又称组成性基因表达(constitutive gene expression)，是指在个体发育的任一阶段都能在大多数细胞中持续进行的基因表达。其基因表达产物通常是对生命过程必需的或必不可少的，且较少受环境因素的影响。这类基因通常又被称为管家基因（housekeeping gene）。,其特点为： (1) 不易受环境变化影响，表达产物是整个生命过程中都持续需要的，是细胞存活所必须的； (2) 表达水平较恒定，只受到启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。 如，三羧酸循环是一枢纽性代谢途径，催化该途径各阶段反应的酶的编码基因就

3、属这类基因。,适应性表达是指环境的变化易使其表达水平发生变动的一类基因的表达。 这类基因包括：(1) 可诱导基因(inducible gene)：在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因是可诱导的。 (2) 可阻遏基因(repressible gene)：在特定环境信号刺激下，如果相应的基因对环境信号应答时被抑制，这种基因是可阻遏的。,这类基因的特点为： (1)易受环境变化影响； (2)除受到启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响外，还受其他机制调节。 这类基因的调控序列含有特异刺激的反应元件。,适应性表达的结果产生了两种现象：一种为随环境条件变化基因表达水平增

4、高的现象，称为诱导(induction)。产生诱导作用的小分子物质称为诱导物(inducer)。 另一种为随环境条件变化而基因表达水平降低的现象，称为阻遏(repression)。产生阻遏作用的小分子物质称为辅阻遏物(corepressor)。,根据操纵元对于调节它们表达的小分子的应答反应的性质，可将操纵元分为可诱导的操纵元和可阻遏的操纵元。,正调控：在没有调节蛋白存在时，基因是关闭的，加入调节蛋白质后基因的活性被开启。 负调控：没有调节蛋白时，基因表达，加入调节蛋白后基因表达活性便关闭。 负调控系统提供了一个万一保安机制：即万一调节蛋白失活，酶系统可照样合成，只不过有所浪费，而决不会使细胞因

5、缺乏该酶系统而造成致命的后果。,未发现,基因表达基本要素,1 顺式作用元件（cis-acting element）：又称分子内作用元件，指存在于DNA分子上的一些与基因转录调控有关的特殊序列。 在原核生物中，大多数基因表达通过操纵子模型进行调控，其顺式作用元件主要由启动子、操纵基因和调节基因组成。,反式作用因子（trans-acting factor）：又称为调节蛋白，指一些与基因表达调控有关的蛋白质因子。 原核生物中的反式作用因子主要分为特异因子、激活蛋白和阻遏蛋白。,原核生物基因表达调控的特点,（1）转录水平的调控(transcriptional regulation)：即细胞控制从其DN

6、A模板上转录其特异的mRNA的速度。大多数基因表达都属于转录水平的调控，主要形式为操纵子调控。转录水平的调控除了操纵子之外，还有其它各种形式，如噬菌体基因表达的时序调控。,（2）翻译水平的调控（translational regulation）：由于原核生物其转录和翻译过程是耦联的，mRNA转录后的加工修饰基本不存在，因此转录后水平的调控主要表现在翻译水平(translational level)。翻译水平的调控表现在mRNA合成后，控制从mRNA翻译成多肽链的速度，包括翻译的起始、延伸和终止过程。,第二节 操纵元的原型乳糖操纵元,一、操纵元模型的提出 20世纪初就发现了酵母细胞中酶的诱导现象

7、：分解底物的酶只有在底物存在时才出现。 法国巴斯德研究院的Francois Jacob与Jacques Monod于1960年在法国科学院院报(Proceeding of the French Academy of Sciences)上发表了一篇论文，提出乳糖代谢中的两个基因被一靠近它们的遗传因子所调节。,操纵元模型：一个或几个结构基因与一个调节基因和一个操纵位点组成一个操纵单元。在操纵元中，结构基因产生mRNA并作为模板合成蛋白质；而调节基因则产生一种阻遏蛋白与操纵位点相互作用。,一、乳糖操纵元的调控机理,在细菌中，同一代谢途径的所有酶的合成调控大多是一致的。大肠杆菌中分解利用乳糖的酶除了-

8、半乳糖苷酶外，还需要使乳糖进入细胞的-半乳糖苷透性酶和能将乙酰基从乙酰辅酶A分子上转移到-半乳糖苷上的-半乳糖苷乙酰基转移酶。,1 调控位点 (1) Operator 操纵基因 (2) CAP(catabolite gene activation protein) or CAP(cAMP受体蛋白)结合位点 (3) Promotor 2 别乳糖为诱导物：乳糖进入细胞后由-半乳糖糖苷酶催化，变为别乳糖，此糖才是一种较强的诱导物，能与阻遏蛋白结合。,乳糖操纵元是表现为一个可诱导的操纵元。,安慰诱导物：对于-半乳糖苷酶来说，除了能被半乳糖苷酶诱导外，一些能被该酶识别但不能被分解的半乳糖苷化合物，如异丙

9、基-D硫代半乳糖苷（IPTG）。IPTG有极强的诱导效应，而本身又不被分解。,3 本底组成型(background constitutive synthesis)：因为阻遏蛋白对于lacO的结合并非是永久性的，而是有一个1020min的半衰期；虽然lacO处于游离状态的时间极短，但有时RNA聚合酶就抓住这个机会进行一次转录。,二.阻遏蛋白与乳糖操作子的相互作用,1 操作子上与阻遏蛋白结合的位点 阻遏蛋白的分子量为38KDa，由四个相同的亚基组成。每个细胞含有510个这样的四聚体。每个亚基可以结合一分子IPTG。lacI基因表达效率很低，一个细胞周期中只合成12个lacI mRNA，且lacI基

10、因的转录是组成型的，不受任何阻遏蛋白的控制，只受自身启动子强度的控制。,操纵位点的回文序列,阻遏蛋白结合区域为26bp，-5+20,阻遏蛋白结合位点的DNA序列的对称性与阻遏蛋白四聚体的对称性是相应的。以+11为对称轴。每边为两段各6个bp的对称序列（TGTGTG和AATTGT）。甲基化实验表明，+3-+19区段中许多嘌呤碱基可被阻遏蛋白保护而免于甲基化。,2 阻遏蛋白结构,阻遏蛋白的结构：用胰蛋白酶消化分析 N端159aa头部片段：为HTH，与操纵基因DNA的大沟结合；与lacO的接触方式完全与完整的阻遏蛋白一样。 核心区：有6个折叠，诱导物就结合在两个核心区之间的裂缝中； C端为两组亮氨酸

11、拉链，形成四聚体。,HTH,HTH是许多原核生物中蛋白质与DNA相互作用的 基础。 HTH由两个短的a-螺旋片断组成，各约7-9个氨基酸，中间由一条-转角隔开。 两个短的a-螺旋片断有一个称为识别螺旋，因为含有许多能与DNA相互作用的氨基酸。这个螺旋定位于DNA大沟中。,亮氨酸拉链,亮氨酸拉链是一种特殊的a螺旋。它的疏水氨基酸集中排列在螺旋的一侧，疏水的表面是二个蛋白质分子构成的接触点。 其显著特点是亮氨酸的频繁出现，每7个氨基酸残基出现1个。使之沿a-螺旋的疏水侧排列为直线，有如拉链结构，故称为亮氨酸拉链。,阻遏蛋白单体的三级结构,鋅指结构,锌指是每一个指结构具有以下的保守序列: Cys-X

12、2-4-Cys-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His。这段保守序列中的两个半胱氨酸残基和两个组氨酸残基与锌离子形成配位键, 形成环, 因此称为锌指, 上述具有Cys和His的指结构称为Cys2/His2指。每个指结构有23个氨基酸残基, 指结构之间的距离为78个氨基酸残基。,靠Zn 2+与对侧的一个-折叠结构相连，其识别螺旋能嵌入DNA双螺旋的大沟中而与之结合。,3 阻遏蛋白与操作子的解离,阻遏蛋白四聚体结合于操作子时，诱导物可与阻遏蛋白的核心片段结合。结合了诱导物后，核心片段发生了变构，这一作用通过铰链区再传导到头部片段，引起整个四聚体构象的改变，从而降低了与操作子的结合能力，阻

13、遏蛋白就离开操作子。,阻遏蛋白与其他许多位点特异性的DNA结合蛋白一样。如RNA聚合酶，都具有以较低的亲和力与随机的DNA序列相结合的能力。因此，细胞内并不存在游离的阻遏蛋白四聚体。 阻遏蛋白四聚体与操作子的结合常数是与随机序列结合常数的4106倍。,但数量巨大的随机序列是与操作子竞争阻遏蛋白的重要因素.如无诱导物存在,细胞内一个阻遏蛋白四聚体结合操作子的几率仅为随机序列的25倍. 因此,任何使阻遏蛋白与操作子的特异性亲和力下降20-30倍的突变都能使lac 酶系统的合成变为组成型表达。,无诱导物时, 细胞内有一个阻遏蛋白四聚体结合在操作子上, 其余全部随机结合在其他DNA上。加入诱导物后,阻

14、遏蛋白因变构作用使之与lacO的亲和力下降1000倍, 但与非特异性序列的亲和力不变, 因此, lacO上的阻遏蛋白迅速转移到随机的DNA序列上。,诱导物的结合解离模型,诱导物和阻遏蛋白结合的模型,三、乳糖操纵元的正调控,在遗传学方面，人们已经分离出两类使乳糖操纵元在无葡萄糖有乳糖存在时也不能表达的突变体，一类位于编码CAP的cap基因上；另一类位于编码合成cAMP的腺苷酸环化酶基因cya上。细胞中CAP的合成是组成型的，因而相对稳定。,具有正调控能力的cAMP-CAP复合物的多寡主要取决于cAMP的含量。 负责合成cAMP的是基因cya编码的腺苷酸环化酶。当细菌利用葡萄糖分解供给能量时，其代

15、谢中间产物可能对基因cya的转录有抑制作用，导致cAMP生成少而分解多，cAMP含量低；相反，当环境中无葡萄糖可供利用时，cAMP含量就相应升高。 当cAMP浓度升高时，CAP 与cAMP结合并发生空间构象的变化而活化，即能以二聚体的方式与特定的DNA序列结合。,腺苷酸环化酶位于细胞膜上。该酶的活性与细胞膜的组织结构和生理状态，特别是与负责葡萄糖运输的磷酸烯醇式丙酮酸磷酸基转移酶的活性有关。,因此，cAMP-CAP不仅调控乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等糖类代谢有关的酶，而且三羧酸循环和呼吸链酶系统中的大多数酶，分解各种碳源底物的酶，降解某些氨基酸的酶，乙醛酸途径的酶等，均表现为葡萄糖效应敏感。,乳糖

16、,CAP是二聚体蛋白质,亚基的分子量为22.5KDa。在启动子上的集合区域一般包括TGTGA,在乳糖操纵元中为对称序列,但大多数序列为非对称的序列, 这可能反映了cAMP-CAP系统对不同的操作元有不同程度的控制。 不同的操纵元中,CAP位点与转录起始点的距离相差很大:在乳糖操纵元中位于-72-2;半乳糖操纵元中-76-47;阿拉伯糖操纵元中为-107-78.,实验发现,缺乏-35序列的操纵元对cAMP-CAP系统的依赖性更大。依赖的操纵元都没有很好的-35序列,有的甚至没有很好的-10序列。因此cAMP-CAP与其结合位点的相互作用及RNA聚合酶与-35序列的相互作用是相关的，都具有促进转录

17、起始的作用。 促进转录的可能机制是促进DNA的解旋，使开放性启动子复合物能够形成。,乳糖操纵子的强诱导既需要有乳糖的存在，又需要没有葡萄糖可供利用。 通过这种机制，细菌优先利用环境中的葡萄糖，只有无葡萄糖而有乳糖时，细菌才能充分利用乳糖。由此可见，对乳糖操纵子来说CAP是正调控因子，乳糖阻遏蛋白是负调控因子。,乳糖操纵子属于可诱导操纵子(inducible operon)，这类操纵子通常是关闭的，当受效应物作用后诱导开放转录。这类操纵子使细菌能适应环境的变化，最有效地利用环境提供的能源底物。,第三节 操纵元的其他调控形式,一、具有双启动子的半乳糖操纵元（gal operon）,细胞代谢半乳糖，

18、需要三种酶，即半乳糖激酶（galK），半乳糖转移酶（galT），半乳糖表异构酶（galE）。 Gal 既可为碳源，同时UDPGal（尿苷二磷酸半乳糖）又是合成细菌细胞壁的重要前体。,特点,(1) 负调控 (2) 双启动子相互重叠。galP1是依赖于cAMP-CAP的，转录起点为S1；galP2是不依赖于cAMP-CAP的，转录起点为S2。两个启动子各有自己的Pribnow框，两者相距5bp。无35顺序。 (3) 双操纵基因； (4)操作子 OE在CAP位点内，操作子 OI在 gene E内,为什么半乳糖操纵子需要两个转录起始位点？,半乳糖不仅可以作为唯一碳源供细胞生长，而且与之相关的物质-尿苷

19、二磷酸半乳糖（UDPgal）是大肠杆菌细胞壁合成的前体。 在没有外源半乳糖的情况下，UDP-gal是通过半乳糖表异构酶的作用由UDP-葡萄糖合成的，该酶是galE基因的产物。生长过程中的所有时间里细胞必须能够合成表异构酶。,如果只有galP1一个启动子，那么由于这个启动子的活性依赖于cAMP-CAP，当培养基中有葡萄糖存在时就不能合成表异构酶。如果唯一的启动子是galP2，葡萄糖不存在的情况下，细菌就不能利用半乳糖，因为cAMP-CAP抑制了galP2，即使低水平合成半乳糖操纵子的酶系统也是不可能。 因此，无论从必要性或经济性考虑，都需要两个启动子的存在，一个满足葡萄糖存在、半乳糖也存在时的低

20、水平的需要；另一个满足无葡萄糖、有半乳糖时高水平的需要。,(1) 有Gal ， P1启动 K,T,E 转录 无 Glu 无Gal ， P1不启动 无Gal ，OE,O I 结合形成环，仅转 有 录20b 有Gal ，P2启动 S2 转录E, 组成型 (2) CAP-cAMP对P1 正调节，对P2 抑制 (3) 阻遏物对P1，P2 都是负调控， CAP-cAMP 含量少时P2 可转录 (机制不清) (4)P1与RNA Pol亲和力 P2与RNA Pol亲和力,调 节,二、阿拉伯糖操纵子(ara O),特点： （1）参与阿拉伯糖的酶基因分为三个操纵元，araBAD，araE，araFG，由一个共同

21、的araC基因调控。 （2）具有双重功能（正调控和负调控）的调节蛋白质（araC）。,在araBAD操纵子中有两个转录相反的启动子，一个是araPBAD启动子，负责araBAD的转录，紧邻于这个启动子是调结位点araI；另一个是araPC启动子，负责调控基因araC的转录，在这个启动子内部及其下游有两个调节基因的调节位点，分别是araO1和araO2。,ara 操纵子的结构,araI,araC基因编码的AraC蛋白存在两种形式，一种即为单纯的AraC蛋白，其表现为具有阻遏功能，也称为Crep；另一种为AraC蛋白和阿拉伯糖结合形成的复合体Cind，具有诱导功能。,Crep结合于操作子araO1

22、时，反馈性地阻遏了其本身的表达。当复合体Cind结合于操作子araI区时，能促使RNA 聚合酶结合于araPBAD位点转录araB、araA和araD三个基因，表现为正调控。,当生长环境中葡萄糖含量高（导致cAMP处于低浓度），阿拉伯糖含量低或高时，araC基因本底转录，产生少量的AraC蛋白，反馈结合于操作子araO1，使RNA聚合酶不能结合araPC，araC基因的转录受到阻遏。,当环境中葡萄糖含量低（相应cAMP高），阿拉伯糖含量高时，阿拉伯糖和少量的AraC蛋白结合形成了诱导型的复合物Cind，它作为正调控因子结合于操作子araI，协同cAMP-CAP促进RNA聚合酶与araPBAD的

23、结合，转录产生了三种酶，使Ara分解；,当由于araBAD编码的蛋白质的代谢使得阿拉伯糖含量降低时，AraC又转换成一个阻遏物，过量的AraC蛋白可以结合在操作子araO1上，阻碍RNA聚合酶在此区域结合，从而关闭了操纵子；或者结合到操作子araI和araO2上，彼此相互作用形成一个约210碱基对的环，阻遏araPBAD和araPC的启动。,特点,（3）AraC有三个结合位点(O1,O2和araI) (4) 是调节子(regulon) (5)双向转录； (6)Pc和O1重叠； (7)C 自身调节,调节,有Glu,无CAPC本底转录，产少量 有Ara AraC,结合于O1,停止转录； 无Glu,

24、有CAPAra+C Cind araI ara P BAD转录； 无Ara 或用完： C过量，可结合到araO1,阻遏 araPc,还可结合到araI和araO2上，成 环，阻遏转录。,第四节 基因转录的时序调控,时序调控:原核生物的生长发育的各个阶段,如细胞分裂,芽孢的形成,噬菌体的复制和噬菌体颗粒的装配等，基因的表达是按照一定的时间顺序而展现的。这种调控机制称为时序调控。,基因表达的时序调控，大多是通过一种或几种蛋白质因子与RNA聚合酶相互作用而实现。 这些蛋白质因子有的替代原有的亚基以协助核心酶识别特定的启动子；有的则修饰RNA聚合酶的核心酶并同时更换亚基；有的蛋白子因子有些RNA聚合酶

25、和转录终止子的作用，从而控制不同阶段基因的表达。,一、枯草杆菌中亚基的更迭,1 枯草杆菌噬菌体SPO1早、中、晚基因表达的转换 SPO1是一种烈性噬菌体，其生活史分为早、中、晚三个时期。在侵染后，早期基因立即被转录。执行这个任务的酶是寄主的RNA聚合酶全酶255 。与此相对应的是早期基因的启动子的-10序列和-35序列与寄主的一致序列很相似。在侵染45分钟后，早期基因停止表达而开始转录中期基因。侵染后812分钟，则中期基因转录又被晚期基因的转录所取代。,SPO1怎样从早进入中、晚期？,SPO1中、晚期基因的表达需要三种SPO1自身的28、33和34调节基因的表达。基因28为早期基因。寄主的RN

26、A聚合酶转录早期基因就产生调节蛋白gp28。 gp28取代55 并与RNA聚合酶结合，从而使RNA聚合酶对早期基因的启动子不识别，但能识别中期基因的启动子。gp33和gp34是晚期基因表达的调节蛋白，它们能取代gp28和55并使RNA聚合酶只能识别晚期基因的启动子。 这种连续更换亚基的途径使SPO1的早、中、晚期三个阶段的基因能有条不紊的表达。,因子的更换用于噬菌体时序调节,2 枯草杆菌孢子生成过程中亚基的替换,枯草杆菌（B.subtilis）中因子用于转录起始的调节 大部分因子转换的例子都发生在孢子形成（sporulation）中 孢子形成分为三个阶段 （1）DNA复制； （2）在细胞的一端

27、基因组被分离； （3）分离的基因组外包上一层子外壳。,涉及三种因子,55、37和29。 它们的职责使不同的：含有55的RNA聚合酶只识别营养基因的启动子；含有37的聚合酶能识别早期孢子形成基因的启动子；含有29的聚合酶则负责中、晚期孢子形成基因的转录。,H,43,K,K,G,F 对E的活性控制,在前孢子中由早期基因产生G, G使RNA聚合酶在前孢子转录晚期孢子形成基因。 另一个早期孢子形成基因产物负责和母细胞中的成分联系,F激活SpoR, SpoR由前孢子分泌，然后它激活膜结合蛋白SpoGA， 活化的SpoGA在母细胞中剪切失活的前体物Pro- E使其成为活化因子E。,二、大肠杆菌热休克基因的

28、表达,大肠杆菌在正常的生长条件下，没有亚基的替换现象。但让大肠杆菌生长在较高的温度下（4250），某些基因则迅速表达。这种现象即称为热休克反应。 在热休克反应中大量表达的基因称为热休克基因。 有些热休克基因产物的氨基酸序列在不同种属中高度相关。,因子的替代可以控制起始,在E.coli，不同类型的启动子需要不同类型的因子 热休克基因（heat shock genes）,从大肠杆菌到人类都具有热休克基因。温度升高，正在进行的蛋白质合成就停止或减少，而一系列新蛋白质则被合成。新蛋白质是热激基因的产物，它们保护细胞免受环境热激的损伤，并且可在其它类似热激的情况下被合成。 有些热休克基因产物的氨基酸序列

29、在不同种属中高度相关，甚至核苷酸序列也有相关性，如分子量为66KDa的DnaK的基因有近一半的核苷酸序列与果蝇的热休克蛋白Hsp70的基因相同。,三、修饰核心酶、替换亚基,T4噬菌体的时序调节依赖本身携带的蛋白对宿主的核心酶加以修饰,改变其和亚基的结合能力,乘机将本身编码的蛋白取代原来的亚基,从而改变RNA聚合酶的识别能力。不同的生长期需要不同的基因表达。 内部蛋白：在T4噬菌体头部的集中小蛋白质分子，其中一种是ADP-核糖转移酶（ADPRT）。 ADPRT可以将一个或两个ADP核糖基连接到RNA聚合酶亚基的精氨酸胍上。,经过修饰的亚基使核心酶对寄主亚基的亲和力下降，对T4基因所编码的蛋白Mo

30、t的亲和力提高。 Mot取代原来的亚基，降低了RNA聚合酶对寄主基因和T4本身第一批早期基因的识别能力。 在转录晚期基因时，RNA聚合酶已被高度修饰：两个亚基分别结合了一个ADP-核糖基，另外还有四个蛋白因子结合于酶分子。这种现象称为超修饰（supermodified）。,四、RNA聚合酶的代换,T7噬菌体的时序调控根据自身的感染特点采用了RNA聚合酶的代换来进行。,由以上可以看出，T7首先时利用寄主的RNA聚合酶转录产生自身的RNA聚合酶及蛋白质激酶，自己的RNA聚合酶又用来转录产生寄主RNA聚合酶的抑制剂，从而完全关闭了寄主的转录体系，建立了自己的转录体系。 这些事例都说明转录水平的调控是

31、最主要和最重要的调控机制。,第五节 以翻译方式来控制基因转录 衰减子系统,色氨酸操纵子,1.结构,2.特点: (1) trpR(89)和trpABCDE(25)不连锁； (2) 操纵基因在启动子内 (3)启动子和结构基因不直接相连，二者被 前导顺序(Leader)所隔开 (4)有衰减子(attenuator),调节,(1) Trp作为辅阻遏物(corepressor) (2)阻遏物和 RNA pol 在P,O重叠区产生竞争性抑制； (3)阻遏物的阻遏能力低，是LacR的1/千； (4) trpO调节合成代谢，存在衰减作用。,衰减作用,1978年yanofsky发现前导序列（leader seq

32、uence） Attenuation(衰减)：控制一些细菌启动子表达中涉及的转录终止调控。 Attenuator(衰减子)：衰减发生处的一种内部终止子序列。 衰减作用：原核生物中通过翻译前导肽而实现控制DNA的转录的调控方式。,在trp mRNA 5端trpE基因的起始密码前有一个长162bp的mRNA片段被称为前导区，研究发现，当mRNA合成起始以后，除非培养基中完全没有色氨酸，转录总是在这个区域终止，产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子，终止trp基因转录。,分析前导肽序列，发现它包括起始密码子AUG和终止密码子UGA，编码了一个14个氨基酸的多肽。该多肽有一个特征，其第10位和11位有

33、相邻的两个色氨酸密码子。正是这两个相连的色氨酸密码子（组氨酸、苯丙氨酸操纵子中都有这种现象）调控了蛋白质的合成。 前导序列中有4个富含GC片断，以两种不同的方式进行碱基配对，有时是12和34配对，有时只以23方式配对。,衰减子（attenuator）：细菌E.coli的trp操纵子中第一个结构基因与启动序列P之间有一衰减子区域。Trp操纵子的序列1中有两个色氨酸密码子，当色氨酸浓度很高时，核蛋白体（核糖体）很快通过编码序列1，并封闭序列2，这种与转录偶联进行的翻译过程导致序列3、4形成一个不依赖（rho）因子的终止结构-衰减子。 转录衰减是原核生物特有的调控机制。,原核生物转录、翻译偶联,图1

34、5-8,高Trp时： Trp-tRNATrp 存在 核糖体通过片段1(2个Trp密码子) 封闭片段2 片段3，4形成发夹结构 类似于不依赖因子的转录终止序列 RNA聚合酶停止转录,产生衰减子转录产物,转录、翻译偶联,产生前导肽,低Trp时： Trp-tRNATrp 没有供应 核糖体翻译停止在片段1 （2个Trp密码子） 片段2，3 形成发夹结构 转录不终止 RNA聚合酶继续转录,除了Trp操纵子外，其他许多负责氨基酸的操纵子都受衰减子的调控,细菌演化出衰减子调控系统的生物学意义可能是： 活性阻遏物和非活性阻遏物的转变可能较慢，而tRNA荷载与否可能更为灵敏； 氨基酸的主要用途是合成蛋白质，因而

35、以tRNA荷载情况为标准来进行控制可能更为恰当；,为什么大多数操纵子又同时需要阻遏蛋白呢？ 因为衰减子系统需要先转录出前导肽mRNA，然后根据前导肽的翻译情况来决定mRNA是否继续转录，而当氨基酸含量丰富时，则无需转录而关闭mRNA的转录活性。 也就是说，需要一个决定基础水平的控制系统，当细胞内氨基酸高于某一水平时，可通过阻遏蛋白，而只有低于这一水平时，才需要用衰减子进行精细调节。,第六节 翻译的调控,转录水平的调控是最主要的，也是最经济，最有效的方式。但转录生成mRNA以后，再在翻译或翻译后水平进行微调，是对转录调控的有效补充。,翻译的过程可分为三种不同的阶段起始、延伸和终止。,一、翻译起始

36、的调控,1反义RNA的调控 1983年，Mizuno和Simon等科学家发现了反义RNA对于基因表达的调控作用，从而揭示了一种新的基因表达调控机制，RNA作为调节物同样能形成一调节网络。,反义RNA的靶顺序是单链核苷酸顺序，其功能是和靶顺序互补，形成一个双链区。 其互补结合位点通常是mRNA上的SD序列（或称为核糖体结合位点RBS）、起始密码子AUG和部分N端的密码子，从而阻遏了核糖体的结合，抑制mRNA的翻译。人们称这类RNA为干扰mRNA的互补RNA（mic-RNA, mRNA-interfering complementary RNA ）。,Mizuno等在研究渗透压的变化对大肠杆菌外膜

37、蛋白的基因表达的影响时发现，在E.coli中有两种外膜蛋白OmpC和OmpF，在渗透压增高时OmpC产量增加，在渗透压减小时OmpC产量受到控制； 与此相反，另一种膜蛋白OmpF在高渗透压条件下产量受控，而低渗时其产量增加。,高渗时，OmpC合成增多，而OmpF的合成受到控制；低渗时，则相反。两种蛋白质的含量随着渗透压的变化而改变，但两种蛋白质的总量不变。 调控机制：当ompC基因转录时，在ompC基因的启动子上游方向有一段DNA序列，以相反的方向同时转录产生一个174个核苷酸的RNA，这个RNA能与OmpF mRNA的前导序列中的44个核苷酸及编码区域形成杂和双链，从而抑制了OmpF mRN

38、A的翻译。OmpC转录得越多，micF也就越多，OmpF蛋白就越少。,意义：（1）反义RNA可以用于研究基因的功能。 传统的方法是使基因的某些碱基发生突变，再观察其表型，但常有无声突变或渗漏突变产生，影响对突变效应的观察。 而反义RNA对基因的抑制比较完全，而且是专一性的。只要将一个不含启动子的克隆基因或其片断的3末端以相反的方向接上一个启动子，然后通过载体引入细胞，就能在细胞内产生反义RNA以抑制染色体上相应基因的表达。 （2）用于人类疾病的治疗。,2mRNA 5端对翻译起始的调控,mRNA的翻译能力主要受控于5端的结合序列 SD序列是位于起始密码子上游约47个核苷酸之前的一段富含嘌呤的5A

39、GGAGG3短小序列，它可以与核糖体16S rRNA 3UCCUCC 5完全互补。 SD序列与16S rRNA 3端的相应序列配对对于翻译的起始是很重要的。强的控制部位造成翻译起始频率高，反之则翻译频率低。,同时，与核糖体的结合强度还取决于SD序列与起始密码AUG之间的距离。SD与AUG之间相距一般以410个核苷酸为佳，9个核苷酸为最佳。,mRNA的5端二级结构也是翻译起始调控的重要因素。 因为核糖体的30S亚基必须与mRNA结合，才能开始翻译。所以要求mRNA 5端要有一定的空间结构。SD序列的微小变化，往往就会导致表达效率上百倍甚至上千倍的差异，这是由于核苷酸的变化改变了形成mRNA 5端

40、二级结构的自由能，影响了核糖体30S亚基与mRNA的结合，从而造成了蛋白质合成效率上的差异。,3. mRNA的二级结构对翻译调控,E.coli的RNA噬菌体MS2,R17,f2和Q都非常小（直径约为250）,是最简单的病毒。基因组长36004200nt，只含4个基因，其中3个基因序列很类似 ：依次是附着蛋白A、衣壳蛋白基因cp、复制酶rep基因、最后基因为lys。,CP(coat protein)含129aa,MW为13.7KDa。 A（atachment）编码附着蛋白（含393氨aa，MW为44KDa）。 Rep（replicase）编码复制酶（含544aa，MW为61KKDa）。 lys（

41、lysis）基因编码裂解蛋白,和cp，Rep基因重叠，该蛋白含75aa。,以R17为例。当R17的RNA进入寄主子细胞后，分子内形成许多碱基配对的二级结构，A基因和rep基因的核糖体结合位点均处于二级结构中，只有CP基因的核糖体结合位点游离于二级结构之外，可以为核糖体识别而合成衣壳蛋白。核糖体对CP基因的翻译冲开了rep基因核糖体结合位点的二级结构，核糖体才与之结合翻译RNA复制酶。 因此Rep基因总是依赖于位于前面的CP位点和核糖体的结合。,虽然Rep基因的核糖体结合位点每次都被CP基因的翻译所打开，但是RNA噬菌体的CP蛋白多肽链产生的量要比复制酶多肽链多得多，这就意味着其间存在一种调控：

42、新产生的外壳蛋白的亚基可以特异地附着到Rep基因的核糖体结合位点，阻止了核糖体的附着。 这样外壳蛋白就成了复制酶基因的特异性翻译阻遏物。在感染10分钟后，外壳蛋白足以阻断复制酶的进一步合成。这样就避免了合成过多的复制酶而造成浪费。,RNA复制酶合成后，便与寄主的三个蛋白质分子Tu、Ts和S1结合为RNA复制酶复合体。 其中RNA复制酶起催化作用，Tu和Ts负责识别正链和负链模板的3末端从而促使复制的起始。 S1只有在以正链为模板复制时是所必须的。这可能是因为噬菌体进入细胞后只有唯一的正链模板，S1能够帮助复制酶复合体识别噬菌体RNA上的特定结合位点。,A蛋白的翻译是趁开始复制时，其位点裸露了出

43、来，在尚未形成二级结构之前核糖体结合上去，进行翻译产生A蛋白的。当结合了12个核糖体后，互补序列就复制完毕，核糖体再也无法进行翻译活动。也就是说，每产生一个正链，大约合成了12个A蛋白。实际上，每个成熟的噬菌体颗粒只含有一分子的A蛋白，因此这种调控是十分经济有效的。,mRNA的二级结构不但可以通过影响核糖体的结合而实现调控，而且mRNA的二级结构也是决定其寿命的重要因素之一。,4. mRNA的寿命对基因表达的调控,原核生物的mRNA的半衰期很短，但不同的mRNA有不同的降解速度。 ，一般大多数mRNA的半衰期为23分钟，这样就能使细菌迅速适应环境的变化。但是细菌中各种mRNA的半衰期还是有相当

44、大的差异，决定其寿命的许多因素都影响到基因的表达。,降解mRNA的酶有两种：RNaseII和多核苷酸磷酸化酶，这两种酶都是35的外切酶，但mRNA的二级结构可以阻遏这些酶的作用。 人们发现不依赖于因子的终止子结构使其mRNA更为稳定。,两个实验现象： （1）基因融合实验发现，终止子序列给融合基因带来更大的稳定性。 （2）凡是降低终止子中柄-噜噗结构强度的突变都造成mRNA稳定性的降低。 由上可见，终止子结构的意义不仅在于转录的终止，而且决定了mRNA的寿命。,但具有不依赖因子的终止子结构的某些mRNA仍然是不稳定的。这表明，可能存在具有一定序列专一性的核酸内切酶能影响mRNA的稳定性。 典型的

45、例子是噬菌体int基因的表达。噬菌体在其生活的不同时期，能产生三种不同的但都包含int基因的mRNA。,（1）早期，噬菌体还未决定进入溶原时期，此时噬菌体不需要整合酶。 由于抗终止蛋白N的作用，左向转录物L2（包含int基因）就越过终止子tL2直至一个很强的终止子处才停止转录。这样，就形成了二个柄-噜噗结构。后附加的柄-噜噗结构恰好构成RNAase的识别位点和作用位点（又称为sib位点），在此处将左向转录物L2切断。这样，整合酶mRNA的3端就暴露于外切核酸酶之下而被很快分解。 由于整合酶mRNA的降解是从3向5方向进行，因此sib位点对于整合酶基因的表达的负调控又称为返回调控。,（2）溶原生

46、长期。在C蛋白的帮助下，从P1起始转录整合酶基因。这时RNA聚合酶没有受到N蛋白的修饰，转录至tL2终止子时即终止。 由于的转录物形成具有11个碱基对的柄-噜噗结构，从而保护了整合酶mRNA的3末端受到外切核酸酶的攻击。 由于P1位于切除酶xis基因内，因此从P1发起的转录只能表达整合酶基因，而没有切除酶的产生。,（3）当受到外界因素的诱导，噬菌体与染色体分离。 这一过程的实现需要切除酶xis基因和整合酶基因的表达。这两个基因的转录物都包含在从PL起始转录的mRNA L2中。这个L2与游离的噬菌体所产生的L2不同，它不包含sib位点，因而不存在返回调控。这样，左向转录物中的切除酶和整合酶都能表

47、达。这两种基因产物使噬菌体从溶原状态转变为裂解生长的过程所必须的。,5. 蛋白质合成的自体调控,有些蛋白质能直接控制自身mRNA的可翻译性。这类蛋白大多是核酸结合蛋白或者与核酸分子相互作用作为其生理功能的蛋白质。 以大肠杆菌的蛋白质合成的核糖体蛋白质的自体调控为例。,核糖体蛋白质合成的自体调控,对于mRNA可翻译性的控制，大多是控制翻译的起始，即控制核糖体和mRNA的结合。 大肠杆菌的核糖体蛋白质有50多种。绝大多数核糖体蛋白质（L7/L12，每个核糖体种由4个分子）在每个核糖体中只有一个分子，因此它们的表达必须与rRNA相协调。,上表中，每个操纵元都有一个自己的调控蛋白。这种调控蛋白质全部为

48、核糖体蛋白质，而且都是在核糖体中直接与rRNA相结合的蛋白质。这些mRNA上与调控蛋白质相结合的序列与rRNA上这一蛋白质结合的序列由很大的同源性，并由形状相似的二级结构。二者都能与其调控作用的核糖体蛋白结合，但rRNA的结合能力大于各mRNA。,当细胞内核糖体蛋白质较少时，即有游离的rRNA存在时，这些调控蛋白质优先与rRNA结合。当rRNA被饱和后，多余的调控蛋白则与mRNA上的结合位点结合。这个结合位点包含或靠近SD序列，因此核糖体就不能与之结合，从而降低了有关基因产物的合成。,例如：在L11操纵子中，起调节作用的为第二个蛋白质L1,它能与多顺反子mRNA的第一个编码区（L11）的起始密码子邻近的SD序列结合，从而阻止核糖体蛋白的起始翻译。,二、翻译的延伸调控,1. 释放因子RF2合成的自体调控,RF2由340个氨基酸组成，但氨基酸密码子并不处于同一阅读框中。其前25个氨基酸密码子处于AUG所在的阅读框中，而其余的315个氨基酸的密码子与前25个氨基酸隔了一个U，这个U与第26个氨基酸（Asp）的密码子GAC的前两个核苷酸构成了RF2所能识别的终止密码子UGA，而且是前一个编码区的同框终止密码子。,当细胞内RF2供应充足时，