蛋白质合成及转运

1、第38章 蛋白质合成及转运,蛋白质的生物合成过程就是将mRNA分子中由碱基序列组成的遗传信息，通过遗传密码破译的方式转变成为蛋白质中的氨基酸排列顺序，因而称为翻译（translation)。,蛋白质的生物合成 合成场所：核糖体 原料：AA、tRNA 、mRNA 、rRNA 酶、蛋白因子 ATP、GTP、无机离子,含有密码子 阅读方向5到3 起始密码和终止密码 3端：真核生物有PolyA尾巴 5端：决定起始密码的选择,一、蛋白质合成的分子基础,（一）模板是mRNA,1961年，Nirenberg 证明了mRNA的模板作用。,mRNA是遗传信息的携带者,遗传学将编码一个多肽的遗传单位称为顺反子（c

2、istron）。 原核细胞中数个结构基因常串联为一个转录单位，转录生成的mRNA可编码几种功能相关的蛋白质，为多顺反子（polycistron）。 真核生物一个mRNA只编码一种蛋白质，为单顺反子（single cistron）。,mRNA结构简图,mRNA上存在遗传密码,mRNA分子上从5至3方向，由AUG开始，每3个核苷酸为一组，决定肽链上某一个氨基酸或蛋白质合成的起始、终止信号，称为三联体密码（triplet codon）。,ORF,从mRNA 5端起始密码子AUG到3端终止密码子之间的核苷酸序列，各个三联体密码连续排列编码一条多肽链，称为开放阅读框架(open reading fram

3、e, ORF)。,每种AA都至少有一种tRNA负责转运 通常一种AA具有几种tRNA,（二）tRNA转运活化的AA到模板上,tRNA分子具有4个位点： 3CCA-OH氨基酸接受位点 识别氨酰-tRNA合成酶位点 核糖体识别位点 反密码子位点,核蛋白体的组成,（三）核糖体是蛋白质合成的工厂,原核生物核蛋白体结构模式,30S小亚基：有mRNA结合位点 50S大亚基： E位：排出位（Exit site） 转肽酶活性 大小亚基共同组成： A位：氨基酰位 (aminoacyl site) P位：肽酰位 (peptidyl site),（一）氨酰tRNA的生成氨基酸的活化,二、翻译的步骤,氨基酸 + tR

4、NA,氨基酰- tRNA,ATP,AMPPPi,氨酰-tRNA合成酶,第一步反应,氨基酸ATPE 氨基酰-AMP-EAMP PPi,第二步反应,氨基酰-AMP-E tRNA 氨基酰-tRNA AMP E,（二）氨酰tRNA合成酶识别：AA、tRNA 、ATP,型和型酶,氨基酰-tRNA合成酶对氨基酸和tRNA都有高度特异性。 氨基酰-tRNA的表示方法： Ala-tRNAAla Ser-tRNASer Met-tRNAMet,氨基酸的活化形式：氨基酰tRNA 氨基酸的活化部位：羧基 氨基酸与tRNA连接方式：酯键 氨基酸活化耗能：2个P,（三）氨酰tRNA合成酶的校正功能 水解非正确组合的AA

5、和tRNA,异亮氨酰 tRNAIle 缬氨酰 tRNAVal 缬氨酰 tRNAIle则被水解： 缬氨酸+ tRNAIle,翻译起始于Met的参与 tRNAMet：携带Met掺入蛋白内部 tRNAiMet ：起始Met 掺入 由同一种tRNA合成酶合成 起始因子识别tRNAiMet 延伸因子识别tRNAMet,（四）一个特殊的tRNA启动蛋白的合成,原核生物中的甲酰Met,fMet - tRNAiMet,（五）翻译起始于mRNA与核糖体的结合,原核生物借助SD序列,（六）蛋白因子帮助合成的起始,肽链合成起始,指mRNA和起始氨基酰-tRNA分别与核蛋白体结合而形成翻译起始复合物 (transla

6、tional initiation complex)。 参与起始过程的蛋白质因子称起始因子（initiation factor，IF）。,S-D序列：在原核生物mRNA起始密码AUG上游，存在49个富含嘌呤碱的一致性序列，如-AGGAGG-，称为S-D序列。 又称为核蛋白体结合位点（ribosomal binding site，RBS) 能与16S核糖体RNA识别，以帮助从起始AUG处开始翻译。,Shine和Dalgarno,S-D序列,原核生物mRNA 5端的SD序列 识别16S rRNA,核糖体结合位点序列,真核生物 5端有核糖体进入部位 帽子结构帮助识别 向3扫描至AUG GCCGCCp

7、urCCAUGG,参与起始过程的蛋白质因子称起始因子（initiation factor，IF）。原核生物起始因子有三种： IF-1：占据A位防止结合其他tRNA。 IF-2：促进起始tRNA与小亚基结合。 IF-3：促进大小亚基分离，提高P位对结合起始tRNA敏感性。,原核生物翻译起始复合物形成,核蛋白体大小亚基分离； mRNA在小亚基定位结合； 起始氨基酰-tRNA的结合； 核蛋白体大亚基结合。,IF-3,IF-1,1. 核蛋白体大小亚基分离,IF-3,IF-1,2. mRNA在小亚基定位结合,IF-3,IF-1,3. 起始氨基酰tRNA与小亚基结合,IF-3,IF-1,IF-2,GTP,

8、GDP,Pi,4. 核蛋白体大亚基结合,A：aminoacyl site P：peptide site E：exit site（大部分在大亚基上）,IF-3,IF-1,IF-2,-GTP,GDP,Pi,起始过程消耗1个GTP。,真核生物翻译起始复合物形成,核蛋白体大小亚基分离； 起始氨基酰-tRNA结合； mRNA在核蛋白体小亚基就位； 核蛋白体大亚基结合。,真核生物翻译起始因子,真核生物翻译起始复合物形成过程,真核生物翻译起始的特点 核蛋白体是80S； 起始因子种类多； 起始tRNA的Met不需甲酰化； mRNA的5帽子和3poly A尾结构与mRNA在核蛋白体就位有关； 起始tRNA先与核

9、蛋白体小亚基结合，然后再结合mRNA,指按照mRNA密码序列的指导，依次添加氨基酸从N端向C端延伸肽链，直到合成终止的过程。,（七）蛋白质合成的延伸（elongation）,肽链的延长是在核蛋白体上连续性循环式进行，又称为核蛋白体循环（ribosomal cycle)。 每次循环增加一个氨基酸，分为以下三步： 进位（entrance） 转肽（peptide bond formation） 移位（translocation）,肽链合成的延长因子,进位,指根据mRNA上一组遗传密码指导，使相应氨基酰-tRNA进入核蛋白体A位。,延长因子EF-T催化进位（原核生物）,Tu,Ts,GTP,GDP,Tu

10、,Ts,GTP,转肽：肽酰转移酶（核糖体参与催化）,延长因子EF-G有转位酶（translocase ）活性，可结合并水解1分子GTP，促进核蛋白体向mRNA的3侧移动。,移位：EF-G（EF-2）,真核生物肽链合成的延长过程与原核基本相似，但有不同的反应体系和延长因子。 另外，真核细胞核蛋白体没有E位，转位时卸载的tRNA直接从P位脱落。,真核生物延长过程,肽酰转移酶活性变为酯酶活性,（八）翻译的终止（terminate）,当mRNA上终止密码（UAA、UAG、UGA）出现后，多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出，mRNA、核蛋白体等分离，这些过程称为肽链合成终止。,终止相关的蛋白因子

11、称为释放因子 (release factor, RF),识别终止密码， RF-1特异识别UAA、UAG； RF-2可识别UAA、UGA。 诱导转肽酶改变为酯酶活性，使肽链从核蛋白体上释放。,释放因子的功能,原核生物释放因子：RF-1，RF-2，RF-3 真核生物释放因子：eRF,原核肽链合成终止过程,RF,原核生物蛋白质合成的能量计算 氨基酸活化：2个PATP 起始： 1个GTP 延长： 2个GTP 终止： 1个GTP 结论：每合成一个肽键至少消耗4个P。,多聚核蛋白体 多核糖体（polysome) 一个mRNA分子可同时有多个核蛋白体在进行同一种蛋白质的合成，这种mRNA和多个核蛋白体的聚合

12、物称为多聚核蛋白体。,多核糖体（polysome）,（九）蛋白质合成的抑制剂,抗菌素（antibiotics） 毒素 抗代谢物 干扰素,蛋白质生物合成是很多天然抗生素和某些毒素的作用靶点。它们就是通过阻断真核、原核生物蛋白质翻译体系某组分功能，干扰和抑制蛋白质生物合成过程而起作用的。,（1）抗菌素,链霉素、卡那霉素、新霉素 主要抑制G-菌Pr合成三个阶段： 起始复合物形成使氨基酰tRNA从复合物脱落； 肽链延伸阶段使氨基酰tRNA与mRNA错配； 终止阶段阻碍终止因子与核蛋白体结合， 已合成的多肽链无法释放， 抑制70S核糖体的解离,四环素（土霉素、金霉素） 作用于细菌30S小亚基，抑制起始复

13、合物形成 抑制氨酰tRNA进入核糖体A位，阻滞肽链延伸； 影响终止因子与核糖体的结合 四环素类抗生素对真核细胞核糖体也有抑制 但不能通过真核生物细胞膜 对70S核糖体的敏感性更高,氯霉素广谱抗生素 与核糖体A位紧密结合，阻碍氨基酰tRNA进入 抑制肽酰转移酶活性，肽链延伸受到影响,50S大亚基蛋白组分,四环素族,抗生素抑制蛋白质生物合成的原理,（2）毒素,白喉霉素 共价修饰使EF-2失活 一条多肽单链，2个二硫键，2个结构域 结构域与细胞表面受体结合 毒素蛋白水解断裂 二硫键还原，产生A、B两片段： B协助A通过细胞膜，A为蛋白修饰酶,催化蛋白发生ADP-核糖基化,白喉毒素(diphtheri

14、a toxin)的作用机理,（3）抗代谢物,结构与天然代谢物相似 竞争性抑制代谢中酶/反应 嘌呤霉素 结构与Tyr-tRNA Tyr相似，进入核糖体A位 连于肽链的C端，形成肽酰嘌呤霉素， 容易脱落，肽链合成提前终止 嘌呤霉素对原/真核生物翻译过程均有干扰 用于肿瘤治疗,嘌呤霉素作用示意图,（4）干扰素（interferon，IFN）,病毒感染的宿主细胞产生 白细胞（）、成纤维（）、免疫（） 干扰素结合于细胞膜，活化抗病毒蛋白基因 诱导产生： 蛋白激酶使eIF2磷酸化失活； 25腺嘌呤寡聚核苷酸合成酶 25A激活磷酸二酯酶水解mRNA,干扰素的作用机理,三、蛋白质的运输及翻译后修饰,蛋白质合成

15、后需要经过复杂机制，定向输送到最终发挥生物功能的细胞靶部位，这一过程称为蛋白质的靶向输送。,（一）、蛋白质合成后的靶向输送,蛋白质的靶向输送（protein targeting）,所有靶向输送的蛋白质结构中存在分选信号，主要为N末端特异氨基酸序列，可引导蛋白质转移到细胞的适当靶部位，这一序列称为信号序列 。, 信号序列(signal sequence),靶向输送蛋白的信号序列或成分,1、分泌蛋白的靶向输送,真核细胞分泌蛋白等前体合成后靶向输送过程首先要进入内质网，再分别被包装成分泌小泡而分泌出细胞。,信号肽(signal peptide),各种新生分泌蛋白的N端有保守的氨基酸序列称信号肽。,信

16、号肽的一级结构,N端侧碱性区,疏水核心区,C端加工区,信号肽引导真核分泌蛋白进入内质网,2、线粒体蛋白的靶向输送,3、细胞核蛋白的靶向输送,从核蛋白体释放出的新生多肽链不具备蛋白质生物活性，必需经过不同的翻译后复杂加工过程才转变为天然构象的功能蛋白。,主要包括,多肽链折叠为天然的三维结构 肽链一级结构的修饰 高级结构修饰,（二）蛋白质翻译后修饰,1、多肽链折叠为天然功能构象的蛋白质,新生肽链的折叠在肽链合成中、合成后进行，新生肽链N端在核蛋白体上一出现，肽链的折叠即开始。可能随着序列的不断延伸肽链逐步折叠，产生正确的二级结构、模体、结构域到形成完整的空间构象。 大多数天然蛋白质折叠都需要其他酶

17、和蛋白质的辅助。,几种有促进蛋白折叠功能的大分子,（1）. 分子伴侣 (molecular chaperon) （2）. 蛋白二硫键异构酶 (protein disulfide isomerase, PDI) （3）. 肽-脯氨酰顺反异构酶 (peptide prolyl cis-trans isomerase, PPI),（1）热休克蛋白(heat shock protein, HSP) HSP70、HSP40和GreE族 （2）伴侣素(chaperonins) GroEL和GroES家族,（1）. 分子伴侣,分子伴侣是细胞中一类保守蛋白质，可识别肽链的非天然构象，促进各功能域和整体蛋白质的

18、正确折叠。,热休克蛋白促进蛋白质折叠的基本作用： 结合保护待折叠多肽片段，再释放该片段进行折叠。形成HSP70和多肽片段依次结合、解离的循环。,HSP40结合待折叠多肽片段,HSP70-ATP复合物,HSP40- HSP70-ADP-多肽复合物,ATP水解,GrpE,ATP,ADP,复合物解离，释出多肽链片段进行正确折叠,伴侣素的主要作用: 为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然空间构象的微环境。,伴侣素系统促进蛋白质折叠过程,（2）. 蛋白二硫键异构酶（PDI）,二硫键异构酶在内质网腔活性很高，可在较大区段肽链中催化错配二硫键断裂并形成正确二硫键连接，最终使蛋白质形成热力学最稳定的天然构象。,（3）. 肽-脯氨酰顺反异构酶,多肽链中肽酰-脯氨酸间形成的肽键有顺反两种异构体，空间构象明显差别。,肽酰-脯氨酰顺反异构酶可促进上述顺反两种异构体之间的转换。,肽酰-脯氨酰顺反异构酶是蛋白质三维构象形成的限速酶，在肽链合成需形成顺式构型时，可使多肽在各脯氨酸弯折处形成准确折叠。,2、一级结构的修饰,（1）肽链N端的修饰 （2）个别氨基酸的修饰 （3）多肽链的水解修饰,鸦片促黑皮质素原(POMC)的水解修饰,N,C,信号肽,PMOC,KR,KR,3、高级结构的修饰,（1）亚基聚合 （