基因编辑技术.ppt

1、CELLECTIS S.A. NASDAQ,2015.11.18 DNA剪切技术治疗1岁女童获成功,基因组编辑技术简介 Genome Editing,2015.11.22 HuangCH J208,修改遗传信息的第一步： 按我们的设计来重组DNA,第一节 基 本 概 念,重组DNA技术： 是指在基因水平上，将目的DNA在体外重组于能自我复制的载体DNA分子上，然后将重组DNA导入宿主细胞中进行增生，以获得大量的目的DNA片段，或以此为基础，通过基因的诱导表达，得到大量相应蛋白质产物的过程。 又称为分子克隆技术或基因工程技术,第二节 重组DNA技术的发展史,基因工程的诞生,1、Berg的开创性实

2、验第一个实现DNA重组,1980年Nobel化学奖,猴病毒SV40的DNA+噬菌体的DNA,2、Boyer-Cohen实验第一个取得基因工程成功,1973年构建双重抗药性重组质粒 1973年是基因工程诞生的元年,第三节 工具酶,Werner Arber 理论预见限制酶,Hamilton O. Smith 得到第一个限制酶,Daniel Nathans 用限制酶切得SV40 DNA片断,1978年Nobel生理或医学奖,1、 “基因剪刀”限制性核酸内切酶,1.定义：能识别双链DNA分子中某特定的核苷酸序列，并 在识别序列内或附近切割DNA双链结构的一类核 酸内切酶（在核酸分子链的内部制造切口的酶

3、）。,2.来源：原核生物,型酶、型酶： 具有限制切割与甲基化修饰活性。型和型酶都没有多大的实用价值。,型酶： 应用广泛，能在DNA分子内部的特异位点，识别和切割双链DNA，其切割位点的序列可知、固定。 通常所说的限制性内切酶就是指型酶。,3.分类：根据结构、作用特点不同，分为三类。,识别位点：即为型酶识别的特殊DNA序列。,通常是48个碱基对、具有回文序列的DNA片段,5 G A A T T C - 3 3 C T T A A G - 5,4.识别和切割位点：, 5突出粘性末端 3突出粘性末端 平头（钝性末端）,5突出黏性末端(EcoR)：,3突出黏性末端(Pst)：,平端缺口（钝性末端）(

4、Sma）,切割方式：对dsDNA 2条链同时切割产生3种不同缺口,2、DNA连接酶,催化DNA中相邻的5端磷酸基和3-OH末端之间形成35磷酸二酯键。 大肠杆菌连接酶，只能连接粘性末端，T4噬菌体连接酶不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。,3、DNA聚合酶,具有53聚合活性、53外切酶活性、35外切酶活性。 可用于合成双链cDNA分子或片断连接，探针制备，序列分析等。,耐热DNA聚合酶 最适反应温度为7580 具有53外切酶活性，不具有35外切酶活性,（1）5端标记 （2）制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身 连接，提高重组效率。 碱性磷酸酶有细菌碱性磷酸酶（BAP）和牛小肠碱性

5、磷酸 酶（CIP）。CIP能在 1% SDS溶液中68 加热15 min而 失活，故CIP较为常用。,4、碱性磷酸酶,去除DNA、RNA、dNTP和NTP 5端的磷酸根。,催化单脱氧核苷酸转移到DNA3-端羟基上。 应用：探针标记，标记测序以及制备人工黏性末端。,催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化。 用途：放射性标记DNA的5端 使缺少5-磷酸基的DNA磷酸化用于连接反应。,单链核酸内切酶，降解单链DNA或RNA。,6、T4多聚核苷酸激酶,7、S1核酸酶,5、末端转移酶,第四节 重组DNA技术常用载体,是指能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子。,一、定义,分类： 克隆载体：用于

6、在宿主细胞中克隆和扩增外 源DNA片段。 表达载体：用于在宿主细胞中获得外源基因 表达产物。,1、具备复制能力。 2、具备一个或多个筛选标志。 3、具备较多拷贝数，易从宿主细胞中分离纯化。 4、具备一个或多个限制性内切酶的单一识别点（多克隆位 点，MCS）。 5、具有较高的遗传稳定性。,二、特点,这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能：如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。,3、常用载体,质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA、酵母DNA,1、质粒（plasmid）:,质粒为细菌染色体之外一些能独立复制并保持稳定遗传的复制子。结构上，它是一种双链闭合环状的DNA分子。

7、,pBR322质粒载体 相对分子质量小，长度为4.3kb。 含有氨苄青霉素和四环素的抗性基因(Ampr和Tetr)。 有24种限制性内切酶位点。 有一个复制起始点（ori）及与DNA复制有关的序列，赋予该质粒复制子特性。 为松弛型复制子。,是感染细菌的一类病毒，寄生于细菌中，并能溶解细菌细胞，故称噬菌体。,2、噬菌体（bacteriophage,phage),噬菌体生活周期,4、病毒,3、酵母 酵母人工染色体（YAC）：用于大片段DNA的克隆。,第五节 重组DNA技术,基本步骤,目的基因的获取,重组DNA导入受体菌,目的基因与载体 连接成重组DNA,克隆载体的选择,重组体的筛选,克隆基因的表达

8、,1、 制备目的基因,（1）化学合成： 已知目的基因的核苷酸序列或根据基因产物的氨基酸序列推导出相应基因DNA碱基序列。 目前使用DNA合成仪合成的片段长度有限，一般用于小分子活性多肽基因的合成，较长的链则须分段合成，然后用连接酶加以连接。,（2）构建基因组DNA文库：,将某种生物细胞的整个基 因组DNA用物理或酶学的方法 切割成预期大小的片断，并将 所有这些片断都与适当的载体 连接，引入相应的宿主细胞中 保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体 上带有了该生物体的全部基 因，称为基因文库。,(3)构建cDNA文库：,(5)直接用限制性内切酶切取、分离： 对一些物理图谱已经确定，背景资料清楚的原核

9、生物、噬菌体及病毒等基因组，可直接用限制性内切酶消化后，通过分离获得目的基因。,(4)聚合酶链反应（PCR） 已知目的基因的基因序列，用PCR从基因组DNA中获得目的基因，或用逆转录PCR方法直接从mRNA获得特定基因的cDNA。,2、克隆载体的选择和构建,用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的噬菌体和黏性质粒； cDNA文库和克隆较小DNA片段通常选pUC系列质粒； 待测DNA序列使用M13噬菌体。,由同一种限制酶切割或不同的限制酶切割形成互补的黏性末端。经退火后，由DNA连接酶连接。,3、目的基因与载体的连接,粘性末端连接：,平端 DNA片段可以在T4 DNA连接酶的作用 下相连接，但

10、连接效率较低。为提高连接效率, 所用的ATP及T4 DNA连接酶的浓度比粘性末端 连接要高些。,（2）平端连接：,（3）定向连接：,（4）同聚物加尾连接：,（5）人工接头连接：,接头是指含有某些限制性内切酶切点的寡核苷酸片段。,4、重组DNA导入受菌体,将重组DNA或其他外源DNA导入宿主细胞的常用方法： 转化、感染、转染、显微注射、电穿孔等。,转化（transformation）：是指将重组质粒DNA导入受体细胞。,转染（transfection）：将重组噬菌体DNA直接引入受体细胞的过程。,转导（transduction）：重组噬菌体DNA分子，在体外经过包 装成具有感染能力的噬菌体颗粒，

11、再以此噬菌体为载体，将 重组DNA导入受体细胞内的过程，也称为感染（infection）。,5、重组体的筛选与鉴定,筛选是指通过某些特定方法，从被转化的细胞群体或基因文库中，鉴别出真正的阳性重组子的过程。,（一）根据遗传表型进行筛选的方法 （1）抗生素抗性筛选 （2）-半乳糖苷酶系统筛选 （二）根据重组子结构特征进行筛选的方法,方法：,（1）抗生素抗性筛选: 大多数载体均带有抗生素抗性基因,（一）根据遗传表型进行筛选的方法,b.插入失活法:外源基因插入到一个抗性基因位点，使 此种抗生素抗性消失，重组体转化的细菌不能在含有 这种抗生素的培养基中生长。,a.构建重组体时，保留了抗性基因活性，所转化

12、的细胞 就能在含此种抗生素的培养基中生长,未转化的细胞 则不能生长。,(插入失活法) 抗生素抗性筛选,（2） -半乳糖苷酶系统筛选,（二）根据重组子结构特征进行筛选的方法,（1）快速裂解菌落并鉴定分子大小 （2）内切酶酶切图谱鉴定 （3）分子杂交 （4）PCR （5）核酸序列测定,（1）分离：提取和获得目的基因和载体 （2）切割：分别对目的基因和载体DNA 酶切； （3）连接：目的基因与载体连接，形成 新的重组 DNA分子； （4）转化：用重组DNA分子转化受体细 胞； （5）筛选：筛选转化成功的细胞克隆 （6）表达：培养获得外源基因的细胞或 生物体，获得所需的遗传性 状或表达出所需要的产物。

13、,小结：,修改遗传信息的第二步： 怎样将需要的信息导入到细胞？,重组质粒DNA转化微生物,化学转化法 电转化法 基因枪转化法,电转化法的特点 适用微生物多 效率高 死亡率高,化学转化法的特点 适用微生物较少 效率较高,基因枪转化法的特点 适用微生物较少 效率较高,革兰氏阳性菌的转化 一般需要制备原生质体,真菌的转化 一般需要制备原生质体,植物遗传转化方法和技术,根癌农杆菌介导的植物转基因,图10-1 农杆菌侵染伤口的模式图,基因枪介导法 电转化法 PEG转化法 花粉管通道法,动物遗传转化方法和技术,原核显微注射法 胚胎干细胞介导法 病毒载体法,1980年代初，ES细胞分离和体外培养成功奠定了基

14、因重组/敲除的技术基础 1985年首次证实了哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因重组/敲除的理论基础 1987年，Thompsson et al首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型 在随后的时间里基因敲除技术得到了进一步发展和完善,基因重组/敲除的概念及简史,基因敲除的原理,基因突变,RNAi,同源重组,RNAi引起基因敲除的机制,同源重组进行的基因敲除是通常意义上的基因敲除 适用范围：适用的细胞既可以是原核细胞，也可以是真核细胞; 原理(应用DNA同源重组原理)：通过外源载体和内源靶位点相同的核苷酸序列之间的同源重组,使外源DNA定点整合到靶细胞的特定的基因座上,同源重组引起的基因敲

15、除,单交换,双交换,图1,图2,同 源 重 组 原 理 图 示,构建与靶基因同源 (1015kb)的载体,外显子插有新霉素抗性基因 （neor）作为正选择,疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因作为负选择,neor 和HSV-tk作双重筛选 存活的ES细胞,将重组体导入ES细胞，体外培养,显微注射,回交得到X被敲除的动物,表型分析,同源重组引起的基因敲除ES细胞,技 术 路 线,图 示,ZFN 技术原理,锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸内切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。,锌指结构中每一个螺旋可以特异识别3

16、-4个碱基； 人工设计识别特异DNA序列的螺旋采用如上的通用序列，通过改变其中7个X来实现识别不同的三联体碱基，TGEK是多个螺旋间的连接序列； 构建成对人工锌指结构域和FokI融合蛋白（ZFN）可以在指定区域切断DNA双链。,ZFN 技术,锌指核酸酶介导的定向染色体删除,研究人员可以利用ZFN技术进行各种基因编辑，比如基因敲除。已建立有ZFN库，识别多种DNA序列，但还不能达到识别任意靶DNA的目的，其应用受到一定的限制。,崭新的技术 - TALEN 经典的挑战 染色体DNA序列的人工编辑修改 （点）突变：Silent；Missense； Nonsense；Frame shift （基因敲除

17、，Knockout） 片段删除 片段插入 目的与用途：生物模型；表达工具；基因治疗,崭新的技术解决经典的挑战,靶向基因技术,经典方法 ： 自杀质粒，同源重组 几率低(1 HR event per 106 cells），难！ 饱含希望与失望的技术： ZFN，被Sigma公司垄断 新的里程碑： TALEN,TALEN技术,基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases)的靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，现已应用于细胞、酵母、斑马鱼与大鼠等各类研究对象。 技术原理： 表达一个重组核酸酶，在靶点识别结构域的作用下

18、，核酸酶识别靶点核酸序列，并发挥内切酶活性，从而打断目标基因，完成基因敲除的过程。,1989年 植物病原体黄单胞菌属 （Xanthomonas spp.） avrBs3 基因被克隆。 2007年 发现其序列特异性核酸结合特性， avrBs3 TA 2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译 由34个aa组成一个单元模块，重复17 -18次 34个aa中的第12和13个氨基酸（Repeat Variant Di-residue, RVD) 对应识别一个目标碱基,TALEN 发展过程,人工构建TALE模块识别指定核酸序列,102碱基模块单元, 14 18个重复,

19、真核表达,特异识别指定的14 -18 个核酸序列并与之结合,34氨基酸单元,TALEN 发展过程,TALEN (TALE+FOK I) 表达质粒对,TALEN 基因敲除,X 2,TALEN 表达质粒对转染、表达 切割靶位点,切割诱发DNA损伤修复机制（nonhomologous end-joining，NHEJ）。由于在此修过程中总是有一定的错误率存在。在修复中发生移码突变错误的个体即形成目标基因敲除突变体,TALEN介导的同源重组,同源重组发生率升高几个数量级,HR,Left arm,Right arm,Left arm,Right arm,点突变,片段删除,基因敲入,2011年8月， Na

20、ture Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。 一篇人类干细胞 Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases 一篇大鼠 Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs 两篇斑马鱼 Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs Heritable gene targeti

21、ng in zebrafish using customized TALENs 一篇综述 Move over ZFN,TALEN的最前沿,TALEN靶向（基因敲除）技术基本流程,选择、确定靶点 2. TALE识别模块串联构建 3. TALEN真核表达质粒构建 4. TALEN真核表达质粒转入（卵）细胞，表达TALEN重组蛋白 5. 检测突变效率，筛选（移码）突变体,X 2,X 2,X 2,靶点的DNA序列特征： 相隔17-18bp的两段14-18bp序列作为靶点 参考文献：Cermak et al., Efficient design and assembly of custom TALEN

22、and other TAL effector-based constructs for DNA targeting, Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 12, e82. 在线靶点选择设计软件：/node/add/talef-off/,选择确定TALE靶点,TAL的核酸识别单元为34aa模块中的双连氨基酸（RVD） RVD与A、G、C、T有恒定的对应关系，即NI识别A，NG识别T，HD识别C，NN识别G，非常简单明确 欲使TALEN特异识别某一核酸序列（靶点），只须按照靶点序列将相应TA

23、L单元（14 -18个）串联克隆即可。,TALE识别模块串联构建,具专利保护的克隆构建系统,具专利保护的克隆构建系统,步骤一：靶点识别单元串联,步骤二：TALEN表达质粒构建,具专利保护的克隆构建系统,将靶点识别模块克隆入真核表达载体，得到Talen质粒对 靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达载体中。此真核表达载体含有TAL的其它必需结构域并在C端融合有FokI序列。 目前，TALEN系统利用FokI的内切酶活性打断目标基因。因FokI需形成2聚体方能发挥活性，在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻（间隔17碱基）的靶序列（14 - 18个碱基）分别进行TAL识别模块构建。,X 2,真核表达

24、TALEN质粒对,步骤三. 将TALEN质粒对共转入细胞中实现靶基因敲除 TALEN质粒对共转入细胞后，其表达的融合蛋白即可分别找到其DNA靶位点并与靶位点特异结合。此时，两个TALEN融合蛋白中的FokI功能域形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，于两个靶位点之间打断目标基因。,FOKI 内切酶打断靶点区,内切酶的切割诱发DNA损伤修复机制（nonhomologous end-joining，NHEJ）。由于在此修过程中总是有一定的错误率存在。在修复中发生移码突变错误的个体即形成目标基因敲除突变体。,突变体形成,PCR 酶切法 利用靶点设计时挑选的，位于相邻靶位点之间的特异性内切酶位点，进行P

25、CR产物酶切鉴定。 当左右靶点之间没有合适的酶切位点时可使用CEL-I核酸酶检测。 经验规律：= 2%可用，=10%很好,TALEN切割效率检测,TALEN切割效率检测,启动子 ABCDEF stop-Target site - DEFHIJK,启动子 ABCDEFHIJK,共转染 荧光素酶检测质粒 + TALEN质粒 1 + TALEN质粒 2,荧光素酶检测法,发光倍数与切割效率之间的定量关系尚缺乏充分研究。 有文献表明，发光倍数达1.5至2倍即可有效获得突变体。,TALE技术应用范围,细菌：尚无报道，已另有多种高效靶向技术。 真菌：有报道，TALE原理可行。 植物：TALE原理发现于植物，

26、需特定转基因技术。 动物细胞：TALE原理可行，各细胞系效率不一。 斑马鱼：有TALEN基因敲除报道，尚无点突变与敲入报道。 小鼠、大鼠原理肯定可行，但尚无报道（技术太新，转基因动物构建实验周期较长）。 TALEN应用扩展的技术关键： 切实可靠的表达系统。 高效的转基因及克隆筛选技术。,TALEN与主要类同技术比较,siRNA 优于TALEN 可瞬时转染快速观察效果 Knockdown效果确实，可用于必须基因 逊于TALEN 瞬时转染效果短暂 不是彻底knockout 慢病毒稳转发生染色体随机整合 ZFN 优于TALEN 经验积累多，技术较成熟 逊于TALEN 技术复杂，难度高，被Sigma公

27、司垄断 靶点序列要求高，难找 Off-targeting现象严重 经常有显著细胞毒性,CRISPR-Cas系统基因修饰技术,Biotechnology: Rewriting a genome Nature495,5051(07 March 2013)doi:10.1038/495050a,1 CRISPR-Cas概述,1987年，日本大阪大学（Osaka University）在对一种细菌编码的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的两端还存在一段不太长的特有

28、的序列。 2013以后，研究者们在包括science和nature biotechnology等著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR-Cas系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精确的基因修饰。,1 CRISPR-Cas概述,CRISPR-Cas：一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。,CRISPR-Cas主要由两部分组成：,识别,切割,1 CRISPR-Cas概述,1.1 CRISPR结构,CRISPR： （clustered regularly interspaced short palindromic repeats） CRISPR 是一个

29、特殊的DNA重复序列家族, 广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR 位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats) 组成, 重复序列的长度通常 2148 bp, 重复序列之间被 2672 bp 间隔序列(spacer)隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列（space）与靶基因进行识别。,1.1 CRISPR结构,1.2 Cas家族,Cas（CRISPR associated）： 存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。,2 CRISPR-Cas系统的发现,CRIS

30、PR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。,2 CRISPR-Cas系统的发现,2 CRISPR-Cas系统的发现,2 CRISPR-Cas系统的发现,CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫, 而这种特异性是由间隔序列（spacer）决定的。在宿主防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌进化了CRISPR 介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是由CRISPR 间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔序列（spacer）来实现的。,2 CRISPR-Cas系统靶向要求,最主要的要求： PAM（protospacer-adjacent motif）为NGG。,2 CRISPR-Cas系统靶向要求,在人类基因组中，平均每8bp就出现一个NGG PAM。,2 CRISPR-Cas系统靶向要求,3 CRISPR-Cas系统介导基因修饰,