8分子生物学研究方法.ppt

1、第五篇 分子生物学研究方法,分子生物学研究之所以从20世纪中叶开始得到高速发展，其中最主要的原因之一是现代分子生物学研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。,基因工程：在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。,基因工程（Gene Engineering）是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表

2、达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术.,操 作 (2) 将文库蛋白的编码基因片段与GAL4转录激活域融合表达的cDNA文库质粒转化入同一酵母中; (3) 若文库蛋白与目的基因相互作用，可通过报告基因的表达将文库蛋白的编码基因筛选出来. 在这里作为诱饵的目的基因就是启动子DNA片段，文库基因所编码的蛋白就是启动子基因结合蛋白. 酵母单杂交技术广泛用于DNA与蛋白相互作用的研究。,5.4.3 酵母双杂交系统,用于分离与某一已知蛋白发生相互作用的蛋白质基因,酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子， 如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结

3、构域: DNA结合结构域可与DNA序列的特定位点即上游激活序列结合；转录激活结构域协助RNA聚合酶复合体激活上游激活序列（UAS）下游基因的转录。这两个结构域的功能是独立的。正常情况下它们是同一种蛋白的组成部分，如果利用DNA重组技术将其分开并放置在同一宿主中表达也不能激活相关基因的转录。,GAL4蛋白： 酵母半乳糖苷酶基因gal的转录激活因子，该蛋白结合在gal基因上游激活区（UAS）可启动gal基因的转录. GAL4蛋白可分为两个区域： DNA-BD：DNA结合域，N-末端1-147aa; AD：转录激活域，C-末端768-881aa;,酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测

4、蛋白-蛋白的相互作用。主要有两类载体: 含DNA -binding domain的载体; 含DNA-activating domain的载体。上述两类载体在构建融合基因时， 测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。,酵母双杂交原理：利用融合蛋白的策略，将蛋白X与BD融合，蛋白Y与AD融合，将它们导入酵母细胞中共表达，如果X和Y相互作用，则会导致BD与AD在空间上接近，形成一个有功能的转录激活因子激活下游报告基因的表达。,报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。酵母双杂交系统中的报

5、道株是酵母细胞。 酵母双杂交系统的优点: 易于转化、便于回收扩增质粒。 具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。 酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。,5.5 定点突变技术,突变是研究基因结构与功能的最基本手段。,经典方法：分离自发突变体或用物理、化学诱变剂处理活体来获得突变，再根据突变体的表型，采用遗传学方法鉴定相应基因。 体外诱变：对克隆化的DNA进行诱变处理，改变其核苷酸序列，从而获得突变基因，用于基因工程、蛋白质工程等研究。,定向进化的原理,70年代初x174DNA（ssDNA 5386bp），当用带琥珀突变的ssDNA与变性的野生型DNA片段一起转染细菌时，观察到“

6、标记获救”现象，即产生带野生型基因组的噬菌体。,一、寡核苷酸介导定点诱变的基本流程,化学合成能与野生型DNA模板的靶区域退火，并携带所需突变的寡核苷酸，作为体外合成DNA的引物。 由DNA聚合酶根据模板序列延伸寡核苷酸，产生含有预定突变的双链DNA。 对突变体DNA进行测序，验证靶点的突变，并确保其他区域没有发生额外的突变。,二、诱变寡核苷酸的设计要求,与靶DNA的适当链互补，并注意与模板的其他区域不能错误杂交； 足够的长度与靶序列特异地结合，1-2个碱基改变的引物要求至少25个碱基长度； 错配碱基位于中央位置，使每侧有10-15个碱基与模板链完全匹配； 含有与模板完全杂交的5端区，这样从上游

7、引物起始的DNA合成不至于取代诱变寡核苷酸引物； 诱变寡核苷酸引物3区域有10-15个碱基与模板链完全匹配，形成足够稳定的杂交分子； 无回纹、重复或自身互补序列； 必要时可在诱变寡核苷酸上加入新的酶切位点，或消除靠近诱变点的已有酶切位点。,三、PCR介导的定点诱变,优点：,突变体回收率高； 快速简便，不需制备单链DNA模板； 高温的利用可降低模板DNA形成二级结构的几率； 所有反应可在同一试管进行。,缺点：,PCR扩增DNA时会产生一定程度的碱基错配； 在扩增DNA的3末端加上非预设碱基； 对每套引物和模板，PCR反应的条件都需要优化； 标准PCR不能有效扩增大于3kb的DNA片段。,（一）大

8、引物PCR诱变,（二）重叠延伸PCR诱变(overlapping extension PCR),（三）重叠延伸剪接技术 （splicing by overlap extension, SOE）,（四）同源重组法,5.6 RNAi 技术,RNA是生物体内最重要的物质基础之一，它与 DNA 和蛋白质一起构成生命的框架。但长久以来， RNA 分子一直被认为是小角色。它从 DNA 那儿获得自己的顺序，然后将遗传信息转化成蛋白质。然而，一系列发现表明这些小分子 RNA 事实上操纵着许多细胞功能。它可通过互补序列的结合反作用于 DNA ，从而关闭或调节基因的表达。甚至某些小分子 RNA 可以通过指导基因的

9、开关来调控细胞的发育时钟。,双链RNA（dsRNA）对基因表达的阻断作用被称为RNA干扰（RNA interference，RNAi）。 双链RNA（dsRNA）经酶切后会形成很多小片段，siRNA 和 miRNA 。 siRNA一旦与信使 RNA(mRNA) 中的同源序列互补结合，会导致 mRNA 失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因“沉默”了。,1990年，为加深矮牵牛花( petunias)的紫色，Jorgensen等导入了一个强启动子控制的色素基因。可是结果与预期相反，许多花瓣颜色并未加深，反而呈杂色甚至白色。这是由于转基因和同源的内源基因的表达都被抑制了，Jorgensen把

10、这个现象命名为共抑制(cosuppression) 。 1995 年，康奈尔大学的 Su Guo 博士用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现，反义RNA（antisense RNA和正义RNA（sense RNA）都阻断了基因的表达，他们对这个结果百思不得其解。 直到1998年，Andrew Fire的研究证明，在正义RNA阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是双链RNA 。这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的。于是提出了RNAi这个词。 2002年，Zernicka - Coetz等用双链RNA注射小鼠受精卵和着床前的胚胎，结果发现导入的双链RNA可以特异性的抑制C-mos ， E-

11、cadherin和GFP基因的表达。Judy Lieberman 和 Premlata Shankar首先向公众宣布了在动物中利用RNAi技术治疗疾病的研究进展。 同样在2002年，科学家研究了酵母和四膜虫两种生物体的RNAi现象，他们发现RNAi对染色体的形状有着极大的控制作用。RNAi能永久性关闭或删除一部分DNA，而不只是简单地使DNA暂时沉默。 2004年，Tomoko和他的同事们发现一种小dsRNA能够作用于神经基因的表达，并且能在转录水平上直接诱导神经干细胞向神经细胞分化。这种RNA在基因转录水平上直接参与调控，它被命名为smRNA 。,5.7 噬菌体表面展示技术,噬菌体表面展示技

12、术是一种对多肽功能非常有效的筛选技术,即将外源蛋白分子或多肽的基因克隆到丝状噬菌体基因组中，与噬菌体外膜蛋白融合表达，展示在噬菌体颗粒的表面。由于外源蛋白或多肽的基因型和表型统一在同一噬菌体颗粒内，因此，通过表型筛选就可以获得它的编码基因。基于生物分子与药物靶分子（抗体、受体、抗原、酶的底物等）的亲和力，应用噬菌体表面展示技术可以从多肽库中进行快速筛选，从而成为药物开发的强有力工具。,噬菌体属于单链DNA病毒，其DNA 长约7 000nt，基因组编码11种蛋白质，其中5种为结构蛋白，与噬菌体展示技术相关的是结构蛋白p和p，p前体由73个氨基酸残基组成，其中信号肽为23个残基，根据构成外壳的功能

13、可分四个区，6-24氨基酸残基区域占据噬菌体表面的大部，25-35氨基酸残基区域具有高度疏水性，C端与DNA相结合，构成完整的内壁，N端为可活动的、外露在噬菌体表面的肽段，是插入外源基因的最佳位置. p前体由424个氨基酸残基组成，位于噬菌体的尾部，由四个功能区组成，即信号肽区、受体结合区、C端的疏水区及穿膜区，穿膜区是最外露的区域，是插入外源基因的最佳位置。,基本原理及操作过程：以改造的噬菌体为载体，把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白基因区，如在噬菌体p和p衣壳蛋白基因区的N端插入外源基因，形成的融合蛋白表达在噬菌的表面，不影响噬菌体的生活周期及天然构型，且易被相应的抗体或受体分子识别，外

14、源蛋白或多肽表达于噬菌体的表面，与固定或固相支持物结合，通过适当的淘洗，洗去非特异性结合的噬菌体(即亲和富集法)，选出目的噬菌体，而编码基因作为病毒基因组的一部分可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序得知. 在这一过程中，外源基因是编码启动子DNA结合蛋白的文库基因，而固定或固相支持物分子则为启动子DNA片段. 噬菌体展示技术是一种经济高效的研究生物大分子相互作用的技术，如构建噬菌体随机多肽文库可用来筛选包括抗体、小分子、细胞表面受体等多种分子 。,第十章 基因组与比较基因组学,人类基因组计划(HGP)是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。美国、英国、法兰西共和国、德国、日本

15、和我国科学家共同参与了这一价值达30亿美元的人类基因组计划。这一计划旨在为30多亿个碱基对构成的人类基因组精确测序，发现所有人类基因并搞清其在染色体上的位置，破译人类全部遗传信息。与曼哈顿原子弹计划和阿波罗计划并称为三大科学计划。 随着人类基因组计划的完成，DNA分子中贮藏的有关人类生存和繁衍的全部遗传信息将被破译，它将不仅帮助我们理解人类如何作为健康人发挥正常生理功能，还将最终揭开基因在癌症、早老年性痴呆症、精神分裂症等严重危害人类健康的疾病中的作用。,一、人类基因组计划,基因组(Genome)：就是一个物种中所有基因的整体组成。人类基因组有两层意义：遗传信息和遗传物质。要揭开生命的奥秘，就

16、需要从整体水平研究基因的存在、基因的结构与功能、基因之间的相互关系。 在人类基因组计划中，还包括对五种生物基因组的研究：大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇和小鼠，称之为人类的五种“模式生物”。 HGP的目的是解码生命、了解生命的起源、了解生命体生长发育的规律、认识种属之间和个体之间存在差异的起因、认识疾病产生的机制以及长寿与衰老等生命现象、为疾病的诊治提供科学依据。,人类基因组计划（Human genome project）由美国于1987年启动，我国于1993年加入该计划，承担其中1%的任务，即人类3号染色体短臂上约30Mb的测序任务。2000年6月28日人类基因组工作草图完成。由于人类基因测序和基

17、因专利可能会带来巨大的商业价值，各国政府和一些企业都在积极地投入该项研究，如1997年AMGE公司转让了一个与中枢神经疾病有关的基因而获利3.92亿美元 。,HGP的主要任务是人类的DNA测序，包括遗传图谱、物理图谱、序列图谱和基因图谱四张谱图，此外还有测序技术、人类基因组序列变异、功能基因组技术、比较基因组学、社会、法律、伦理研究、生物信息学和计算生物学、教育培训等目的。,HGP的研究内容,又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性（在一个遗传位点上具有一个以上的等位基因，在群体中的出现频率皆高于1%）的遗传标记为“路标”，以遗传学距离（在减数分裂事件中两个位点之间进行交换

18、、重组的百分率，1%的重组率称为1cM）为图距的基因组图。遗传图谱的建立为基因识别和完成基因定位创造了条件。意义：6000多个遗传标记已经能够把人的基因组分成6000多个区域，使得连锁分析法可以找到某一致病的或表现型的基因与某一标记邻近（紧密连锁）的证据，这样可把这一基因定位于这一已知区域，再对基因进行分离和研究。对于疾病而言，找基因和分析基因是个关键。,1、遗传图谱（genetic map）,物理图谱是指有关构成基因组的全部基因的排列和间距的信息，它是通过对构成基因组的DNA分子进行测定而绘制的。绘制物理图谱的目的是把有关基因的遗传信息及其在每条染色体上的相对位置线性而系统地排列出来。 DN

19、A物理图谱是指DNA链的限制性酶切片段的排列顺序，即酶切片段在DNA链上的定位。 DNA物理图谱是DNA分子结构的特征之一。DNA是很大的分子，由限制酶产生的用于测序反应的DNA片段只是其中的极小部分，故DNA物理图谱是顺序测定的基础,也可理解为指导DNA测序的蓝图。 广义地说，DNA测序从物理图谱制作开始，它是测序工作的第一步。,2、物理图谱（physical map）,随着遗传图谱和物理图谱的完成，测序就成为重中之重的工作。DNA序列分析技术是一个包括制备DNA片段化及碱基分析、DNA信息翻译的多阶段的过程。通过测序得到基因组的序列图谱。,3、序列图谱,基因图谱是在识别基因组所包含的蛋白质

20、编码序列的基础上绘制的结合有关基因序列、位置及表达模式等信息的图谱。在人类基因组中鉴别出占具2%5%长度的全部基因的位置、结构与功能，最主要的方法是通过基因的表达产物mRNA反追到染色体的位置 。,4、基因图谱,原理：所有生物性状和疾病都是由结构或功能蛋白质决定的，而已知的所有蛋白质都是由mRNA编码的，这样可以把mRNA通过反转录酶合成cDNA或称作EST的部分的cDNA片段，也可根据mRNA的信息人工合成cDNA或cDNA片段，然后，再用这种稳定的cDNA或EST作为“探针”进行分子杂交，鉴别出与转录有关的基因。用PolyA互补的寡聚T或克隆载体的相关序列作为引物对mRNA双端尾侧的几百个

21、bp进行测序得到EST（表达序列标签）。,基因图谱的意义：在于它能有效地反应在正常或受控条件中表达的全基因的时空图。通过这张图可以了解某一基因在不同时间不同组织、不同水平的表达；也可以了解一种组织中不同时间、不同基因中不同水平的表达，还可以了解某一特定时间、不同组织中的不同基因不同水平的表达。 人类基因组是一个国际合作项目：表征人类基因组，选择的模式生物的DNA测序和作图，发展基因组研究的新技术，完善人类基因组研究涉及的伦理、法律和社会问题，培训能利用HGP发展起来的这些技术和资源进行生物学研究的科学家，促进人类健康。,二、DNA的鸟枪法序列分析技术,20世纪80年代后期发展起来的酵母人工染色

22、体技术（YAC）为创制基因组物理图提供了极大的方便。,Saccharomyces cerevisiae 酿酒酵母 扁圆形和卵形 ；直径3m； 代时 90min； 16条染色体 ； 300-2000kb； 14106bp； 具真核mRNA的加工活性。,酵母的生物学特征：,YAC（yeast artificial chromosome）克隆载体是最早构建成功的人工染色体克隆载体，能像染色体一样在酵母细胞中正常的复制。它是以pBR322为骨架建立，带有pBR322的复制起点ori和筛选标记基因Ampr，另外还加入作为酵母chr.所必须的一些成分：,一段来自酵母chr.的着丝粒序列（能在细胞分裂过程中

23、将chr.载体均匀的分配到子细胞中）,一段控制酵母chr.复制的自主复制序列（ARS）,一对酵母的端粒序列（来自四膜虫chr.），防止chr.载体与其他chr.相互粘连，并避免在DNA复制过程中造成基因的缺失，从而保证了chr.载体在细胞分裂和遗传过程中的相对独立和稳定。,选择标记TRP1和URA3（酵母Trp和U营养缺陷型的野生型等位基因）,克隆位点存在于酵母酪氨酸tRNA基因赭石突变的校正基因Sup4中。,常用的YAC克隆载体：pYAC3、 pYAC4 和pYAC5，其差别在于Sup4基因上的克隆位点不同。,基因组DNA与YAC臂体外连接过程中产生嵌合体； 通过共转化导入同一个酵母原生质体

24、的不同YAC克隆的有丝分裂重组也会产生嵌合体； 染色体DNA操作困难。,缺点：,三、比较基因组学及功能基因组学研究,基因组（Genome）一词是1920年Winkles从GENes和chromosOE铸成的，用于描述生物的全部基因和染色体组成的概念。1953年Watson和Crick发现DNA 双螺旋结构，标志分子生物学的诞生，随着各学科的发展，当前生物学研究进入新的时代，在生物大分子水平上将不同的研究技术和手段有机的结合以攻克生物学难题。基因组可以理解为：一，基因表达概况研究，即比较不同组织和不同发育阶段、正常状态与疾病状态，以及体外培养的细胞中基因表达模式的差异；二，基因产物-蛋白质功能研究，包括单个基因的蛋白质体外表达