反相色谱流动相的设计复习课程.ppt

1、1,反相液相色谱 流动相的设计,反相液相色谱法 流动相的选择,固定相对分离影响回顾 常用的有机溶剂及其选择性 流动相pH值的影响 流动相和固定相的优化 梯度洗脱程序 柱温的影响 应用举例 其他关键细节,概要,色谱分离的终极目标：关键组分的分离,4,反相液相色谱 流动相,固定相: 键合相类型 (C18 vs 苯基) 颗粒类型(核-壳 vs 整体硅胶),流动相: 溶剂的选择 (乙腈 vs 甲醇) 流动相 pH 温度 梯度,固定相对分离影响回顾,Kinetex 核-壳技术2.6um色谱柱可以提高3倍柱效（与5um全多孔比较）,提高柱效改善分离,提高柱效改善分离,固定相选择性对分离度的影响回顾1,疏水

2、性,立体互动,氢键给予,氢键接受,阳离子选择性,键合相与样品的交互作用:,9,固定相选择性对分离度的影响回顾2,LC实验室，一定要有一套互补性强的色谱柱,相关物质检查之系统适应性试验,各种不同基材色谱柱性能比较,选择正确的固相载体,固定相选择性对分离度的影响回顾3,固定相选择性对分离度的影响回顾4,固定相选择性对分离度的影响回顾5,推荐的固定相选择必备工具: 1、反相色谱柱选择终极指南画报 2、反相色谱柱选择终极指南画册 3、反相柱筛分工具,14,有机溶剂的选择,常用的有机溶剂,流动相的选择比固定相的选择更具有挑战性，因为它的选择的没有限制的。然而，在实际的方法开发中，我们都会大大缩小选项，集

3、中精力在那些会带给我们最大成功可能性的条件上 典型的反相溶剂: 弱溶剂: 水/缓冲盐 强溶剂:乙腈 (64) 甲醇(34) 混合溶剂 (1) THF (1),选择溶剂的考虑因素,一种溶剂的强度取决于疏水性的强弱。溶剂强度会决定洗脱下来一个给定化合物所需的量。 反相溶剂的强度: 水： 0 甲醇 2.6 乙腈 3.1 THF 4.4 溶剂选择需要考虑的其他因素： 甲醇-粘度较高，在小粒径或长柱提高流速时会受到限制 乙腈-价格相对要高 四氢呋喃-低波长下有紫外吸收，粘度高,溶剂强度: 乙腈 Vs 甲醇,35% 甲醇,色谱柱: Gemini 5 m C6-Phenyl, 150 x 4.6mm 流动相

4、: 20mM磷酸二氢钾（pH2.5） % 有机溶剂如图所示 流速:1.0 mL/min 检测波长: 220nm 1.糖精 2.对羟基苯甲酸 3.山梨酸 4.脱氢乙酸 5.对羟基苯甲酸甲酯,20% 乙腈,用乙腈时分析物更早洗脱下来（即使乙腈的百分比更低） 用乙腈洗脱的时候，洗脱顺序发生了变化,溶剂选择性,给定溶剂的洗脱强度由它的疏水性决定（如，庚烷比己烷强，因为它的疏水性更强）然而，溶剂的选择性，是由它的极性性质所决定的（如，庚烷和己烷都具有相同的溶剂选择性）,用不同的溶剂优化4种类固醇的分离,溶剂选择性,溶剂的筛选 (等度条件方法),1.从高比例乙腈开始逐步减少，直到k在2-10之间 （如果可

5、能）,溶剂的筛选 (等度条件方法),2. 用其他溶剂重复操作:,苯基色谱柱溶剂的选择,在任何反相的方法中，选择乙腈或甲醇会对最终方法的选择性有显著的影响。然而，当用苯基固定相的时候（如Luna phenyl-Hexyl;Synergi Polar-RP），你会发现甲醇具有更好的选择性，因为它使得苯基固定相的pi-pi作用更为明显。 这很可能是因为乙腈氰基上pi电子影响了分析物上的pi电子和固定相苯环上的pi电子之间的作用，而甲醇不会有这样的影响。,苯基色谱柱溶剂的选择,色谱柱: Luna 5m C18(2) 150 x4.6mm Luna 5m Phenyl-Hexyl 150 x4.6mm

6、流动相:A: 20mM 磷酸二氢钾 pH 2.5 B: 27% 乙腈 或 50% 甲醇 流速:1.0 mL/min 化合物:北美黄莲提取物 1.黄莲碱 2.小檗碱,苯基色谱柱溶剂的选择,27:73 乙腈 : 20mM 磷酸二氢钾 pH 2.5,Luna C18(2),Luna Phenyl-Hexyl,苯基色谱柱溶剂的选择,50:50 甲醇 : 20mM 磷酸二氢钾 pH 2.5,Luna C18(2),Luna Phenyl-Hexyl,26,缓冲盐和流动相pH值的作用,反相色谱中缓冲盐的选择,对于HPLC方法开发来说，从数量众多的缓冲盐中选择出正确的缓冲盐，非常不容易 但事实不是这样, 因

7、为只需几种缓冲盐就能解决大多数问题! 估计流动相pH值时的实际考虑： 1. 目标物质的稳定性 2.固定相在低pH值条件下水解 酸性强于TFA时，就会造成固定相流失 减少保留，暴露的硅醇基 不同厂家/品牌的填料的稳定极限不同 3.高pH值条件下硅胶溶解 一般的硅胶基质固定相稳定至pH8 保护性键合（如Luna）稳定提高至pH10 有机硅胶杂化（如Gemini）稳定提高至pH12,反相色谱中缓冲盐的选择,反相色谱中缓冲盐的选择,2.5,4.5,7.0,8.5,10,pH值对固定相的影响,任何硅胶基质的反相填料键合和端基封尾之后都会有一定的硅醇基残留。这些硅醇基在pH3.5以上都能够去质子化。去质子

8、化的硅醇基能够与碱性的物质形成离子交换作用，造成峰形拖尾,硅醇基质子化 离子交换减少 峰形拖尾减少,硅醇基去质子化 离子交换作用增加 增加了峰形拖尾,pH值对分析物的影响,反相色谱最主要的保留机理是疏水作用。化合物离子化会使得他们具有极性化合物的行为，减少与固定相的疏水作用，降低保留能力 分子的离子化状态可以由流动性的pH值决定。因此，流动性的pH值能影响具有离子化基团的分析物的保留性能, 疏水性增强 更强保留, 疏水性减小 更弱的保留,pH值对分析物的影响,pH值对分析物保留行为的影响,水溶性流动相,烷烃类键合相,pH值对分析物保留行为的影响,H+,碱化,酸化,水溶性流动相,烷烃类键合相,H

9、+,pH值对分析物保留行为的影响,阿米替林 (pKa 9.4) = （B）碱性,甲苯= (N)中性,萘普生 (pKa 4.5) =（ A） 酸性,pH值对分析物保留行为的影响,首选：pH pKa2 次选：pH pKa2,pH值对分析物保留行为的影响,首选：pH pKa 2 次选：pH pKa 2,化合物pKa的预测,缓冲盐的浓度,一般采用20mM50mM 依据样品浓度，建议为样品浓度的5倍 依据色谱柱硅羟基活度，活度越大，需要浓度越大 对碱性化合物，高浓度缓冲盐可以减弱反相色谱柱的“阳离子选择性” 梯度洗脱和在线混合时注意高浓度缓冲盐的溶解性,反相色谱柱的阳离子选择性,在硅胶表面的带电硅醇基可

10、与带电碱性物质产生离子吸引作用， 可造成正面或负面的影响。,肾上腺素,阳离子选择性改善极性碱的保留,Luna PFP(2),Luna C18(2),阳离子选择性碱性物质峰形变差,Kinetex PFP,Kinetex XB-C18,美沙酮,美沙酮,芬太尼,芬太尼,缓冲盐浓度对阳离子选择性的影响,Luna 5u SCX 100A 2504.6mm,乙腈：50mmol/l磷酸二氢钾（PH3.0）（5：95）,缓冲盐浓度对阳离子选择性的影响,Luna 5u SCX 100A 2504.6mm,乙腈：100mmol/l磷酸二氢钾（PH3.0）（5：95）,45,流动相和固定相的优化,优化流动相选择性,

11、溶剂筛选： 乙腈，甲醇,调节pH值来调整保留和选择性,选择固定相 色谱柱,高效 C18,是否有pH值的 特殊限制？,调节pH值来调整保留和选择性,选择固定相 色谱柱,47,优化流动相和固定相,分析尼古丁及其代谢物,尼古丁 (pKa 8),可替宁,新烟碱,去甲烟碱,优化流动相和固定相,Kinetex C18,是否有pH值的 特殊限制？,49,尼古丁和降解产物：初始低pH值条件筛选,流动相：A 0.1%甲酸水溶液 B 0.1%甲酸乙腈溶液 梯度：10分钟内B%从5%变为95% 流速：1.5ml/min 检测器：254nm 化合物：尼古丁（0.1%）.进样1ul,尼古丁 (pKa 8.5),优化流动

12、相和固定相,Kinetex C18,是否有pH值的特殊限制？,调节pH值来调整保留和选择性,51,流动相： A 10mM 碳酸氢铵 pH 10.5 B 乙腈 梯度：10分钟内B%由5%变为95% 流速：1.5ml/min 检测器：254nm 化合物：尼古丁（0.1%） 进样量1ul,尼古丁及其代谢物：高pH条件下筛选，增加保留,优化流动相和固定相,Kinetex C18,是否有pH值的特殊限制？,调节pH值来调整保留和选择性,Kinetex 在pH 10.5条件下不稳定,有机硅胶杂化 Gemini NX 3um C18,53,尼古丁及其代谢物：最终方法用杂化颗粒,色谱柱： 流动相：pH10.5

13、 A 20mM 碳酸氢铵 B 100%乙腈 梯度 时间 B% 0.00 10 3.00 78 3.10 10 5.00 10 流速：0.5ml/min 进样体积：10ul 温度：25,54,梯度分析,55,梯度分析,梯度洗脱的目的在于在同一个色谱运行下分离疏水差异很大，并且需要很长时间才能在等度洗条件下脱完全的样品。 梯度洗脱： 峰形更尖锐，更好定量 改善对最后洗脱下来的小峰的检测 适于运行完样品后对色谱柱的清洗和再生 适于摸索分析条件,色谱柱： 流动相：70:30 0.1%三氟乙酸水溶液:0.1%三氟乙酸乙腈 流速：2.0ml/min 组成：1.硫脲（标记为t0） 4.苯乙酮 7.苯戊酮 2

14、.咖啡因 5.邻苯二甲酸二甲酯 3.苯酚 6.苯丁酮,56,梯度分析,色谱柱： Luna 3m C18(2) 50 x4.6mm 流速：2.0ml/min 流动相： A：0.1% TFA水 B：0.1% TFA乙腈,1+2,3,4,5,6,7,7,6,5,4,3,2,1,A:B(70:30),B% 5%100% in 5min,梯度斜率,梯度斜率与等度洗脱中的溶剂强度相似,等度洗脱溶剂强度 提高溶剂强度减少分析时间同时降低了分离度 减少溶剂强度增加分离度同时也增加了分析时间 溶剂强度有时会影响选择性,梯度斜率 提高梯度斜率减少运行时间但是同时减少了分离度 减缓梯度斜率增加了分离度但同时也增加了

15、分析时间 梯度斜率有时也会影响选择性,梯度洗脱的目的: 优化分离度的同时缩短分析时间,梯度分析,示例：五种除草剂 色谱柱： Phenomenex Luna C18 150 x 4.6mm,梯度分析,5种除草剂在等度洗脱模式下：,梯度斜率对分离度的影响,梯度斜率：1%/分钟 乙腈20-80%，60分钟,梯度斜率对分离度的影响,梯度斜率：2%/分钟 乙腈20-80%，30分钟,梯度斜率对分离度的影响,梯度斜率：3%/分钟 乙腈20-80%，20min,梯度斜率对分离度的影响,梯度斜率：4%/分钟 乙腈20-80%，15min,分离度不够!,*增加梯度斜率将减少整体的保留时间同时也降低了分离度,起始

16、有机相百分比对分离度的影响,优化后的方法=梯度斜率：3%/分钟 20-80%乙腈，20min,乙腈30-90%，20min 方法调整=梯度斜率：3%/min,梯度斜率：3%/分钟，起始强溶剂=30% 30-90%乙腈，20min,分离度变小!,起始有机相百分比对分离度的影响,*提高起始强溶剂的量，降减少整体的保留和分离度,梯度方法开发,1.从摸索梯度条件开始，判断分析物的洗脱时间： 5-95% 有机相，X分钟（1分钟/厘米柱长） 1504.6mm= B%5-95%15分钟 2、根据最早洗脱下来的组分，调整起始有机相比例 3%有机溶剂等度保持X分钟 3.调整梯度斜率优化分离度或关键物质 减缓斜率

17、，提高分离度（5-95%B，20分钟） 增加斜率，如果分离度足够 （5-95%B，12分钟）,梯度方法开发,4、优化截止有机相比例作为结束 梯度截止在65%B 5. 调整起始有机相比例缩短运行时间（如果没有极性组成的限制） 5-65% B，18分钟 10-70% B，18分钟 15-75% B，18分钟,梯度程序方法转移时的微调,梯度洗脱 最小化滞后体积减少循环时间,Pump A,Pump B,Detector,Injector,Mixer,69,柱温的影响,方法开发中柱温的应用,HPLC方法开发中温度的应用非常具有挑战性，因为它对选择性的影响不可预知 升高温度将会： 1.减少流动相粘度和背压

18、。这样的话可以用更快的流速，或者用更长/粒径更小规格的色谱柱 2.缩短洗脱时间 3.提高方法的重现性（与室温下的操作相比） 然而，不可能确定升高温度是否有利于还是不利于样品的分离。对于一复杂的分离来说，色谱结果中一份的提高几乎都会伴随着其他部分的减少,方法开发中温度的应用,方法开发中温度的应用,在我们的方法开发工作中： 1.初始方法会设在30 色谱柱筛选 流动相的选择和优化 2.更高温度的应用仅在： 需要降低柱压 （通常伴随着提高流速或使用更长的柱子） 30度下不能达到理想的分离度,73,方法开举例1： 梯度优化和固定相筛选,巴比妥酸盐的临床检测,巴比妥酸盐是CNS镇定剂，用于减少麻醉，治疗焦

19、虑和失眠，但同时常被滥用 LC/MS分析这类化合物的困难在于异戊巴比妥和戊巴比妥是异构体，分子量相同，所以必须达到基线分离才行,分离目标： 异戊巴比妥和 戊巴比妥分离,流动相和固定相的优化,碱性样品信息： 无pH值限制 样品干净,溶剂?,乙腈，粘度低,缓冲盐?,低pH值（甲酸）,核-壳C18色谱柱：初始的梯度分析条件,1、迅速，陡峭的梯度斜率确定分析物的大概情况,10-90%B 5min; 16% / min,减小梯度斜率,保留不错 峰形不错 没分开,梯度斜率优化：,10-90%B 5min; 16% / min,10-90%B 10min; 8% / min,10-90%B 40min; 2% / min,其他可选的方法：,核-壳苯基色谱柱 2%/min,核-壳 C18色谱柱 2%/min 用甲醇替换乙腈,79,其他关键细节,强溶剂效应,避免强进样溶剂 应注意最小化管路长度和内径 优化进样器和色谱柱间的连接 选择死体积小的保护柱,w1/2,tR,强溶剂进样,强溶剂效应,进样溶剂比流动相弱可以使样品集中在柱头 从而获得更尖锐的峰形,弱溶剂,弱溶剂进样,强溶剂效应实际案例,进样10uL,进样5uL,方法源：ChP2010一部：刺五加中紫丁香苷的测定,检测器采样频率影响分离效果和柱效,对于保留因子小于3的峰，采样频率可能至关重要,3.0s,0