硕士生物仪器分析之紫外-可见光谱3.ppt

1、光谱和谱学分析 Spectroscopy and Spectral Analysis,Introduction,光是一种电磁辐射，从波长极短的宇宙射线至波长很长的无线电构成一个连续光谱。,Introduction,部分电磁辐射范围 远紫外 100200 nm 近紫外 200400 nm 可见光 400800 nm 近红外 8002500 nm 远红外 25003500 nm,Introduction,谱图范围的选择，决定了仪器采用的光学组件,紫外可见光谱,UV-Vis Spectrophotometer (UV-Vis),紫外线,紫外线是位于日光高能区的不可见光线（100-400 nm）,紫外

2、线,根据生物效应的不同，将紫外线按照波长划分为四个波段 ：,UVC波段（200275 nm） 短波灭菌紫外线； 穿透能力最弱，无法穿透大部分的透明玻璃及塑料； 对人体伤害很大，短时间照射即可灼伤皮肤； 长期或高强度照射还会造成皮肤癌； 紫外线杀菌灯。,UVD波段（100200 nm） 真空紫外线； 穿透能力极弱； 臭氧发生线。,紫外线,UVA波段（320400nm） 长波黑斑效应紫外线； 有很强的穿透力，可以穿透大部分透明的玻璃以及塑料； 可直达真皮层，破坏弹性纤维和胶原蛋白纤维，晒黑； 360 nm波长制作诱虫灯； 365 nm可用于矿石鉴定、舞台装饰、验钞等场所； 虾青素能有效消除UVA对

3、皮肤细胞的伤害 。,UVB波段（275320 nm） 中波红斑效应紫外线； 中等穿透力，波长较短的部分会被透明玻璃吸收； 能促进体内矿物质代谢和维生素D的形成； 长期或过量照射会令皮肤晒黑； 紫外线保健灯、植物生长灯。,优点： 消毒杀菌； 促进骨骼发育； 对血色有益； 偶尔可以治疗某些皮肤病; 紫外线照射直接影响人体维生素D的合成,紫外线的特点,缺点： 使皮肤老化产生皱纹 产生斑点 造成皮肤炎 造成皮肤癌 造成皮肤粗糙,紫外线的应用,化学：涂料固化，颜料固化，光刻，油烟氧化，光触酶 仪器分析：矿石，药物，食品分析 生物学：灭菌，促进植物生长，诱杀蚊虫，人体保健照射,UV-vis spectro

4、scopy is the measurement of the wavelength and intensity of absorption of near-ultraviolet and visible light by a sample.,Ultraviolet and visible light are energetic enough to promote outer electrons to higher energy levels.,The ultraviolet region falls in the range between 190-380 nm. The visible r

5、egion fall between 380-750 nm.,紫外-可见光谱,UV-vis spectroscopy is usually applied to molecules and inorganic ions or complexes in solution.,紫外-可见光谱,The uv-vis spectra have broad features that are of limited use for sample identification but are very useful for quantitative measurements.,分子从电子基态（S0）跃迁到电子

6、激发态（SE）的E远大于振动能级及转动能级的E。 电子跃迁所吸收的电磁波是吸收光谱中频率最高的，即紫外可见光。,分子的总能量是其键能(电子能)、振动能和转动能的总和，当分子从辐射的电磁波吸收能量之后，分子会从低能级跃迁到较高的能级。,基本原理,基本原理（Basic principle）,多原子分子电子能级和跃迁类型,n *,有机化合物外层电子为： 键的电子； 键的电子； 未成键的孤电子对n电子；,吸收频率决定于分子的能级差，其计算式为： E = h 或 E = hC / 式中 E为分于跃迁前后能级差； 、分别为所吸收的电磁波的频率及波长； C为光速； h为普朗克常数。,基本原理（Basic p

7、rinciple）,紫外吸收谱带的形状：较宽,分子吸收电磁波能量后,电子从基态 s0跃迁到激发态, 其同时伴随有振动能级的跃迁+转动能级的跃迁,稀薄气态,浓度增大,低极性溶剂,高极性溶剂,基本原理（Basic principle）,The concentration of an analyte in solution can be determined by measuring the absorbance at some wavelength and applying the Beer-Lambert Law.,朗伯比尔定律,A=吸光度 I0=入射光强度 I=入射光通过样品后的透射强度 摩尔

8、吸光度（cm-1.m-1） C=摩尔浓度(mol) l=光程(cm),Molar absorptivities may be very large for strongly absorbing compounds ( 10,000) and very small if absorption is weak ( = 10 to 100).,朗伯比尔定律,UV/VIS spectroscopy in microplates (or 96 well),水 乙腈 n-Hexane 正己烷 Isooctane 异辛烷 Cyclohexane 环己烷 95%乙醇 Methanol 甲醇 Ethyl eth

9、er 乙醚 Dioxane 1,4-二氧六环 三甲基磷酸酯 Chloroform 氯仿,190 190 200 200 205 205 205 215 215 215 245,常用溶剂的透明界限,Solvent,Lower limit (nm)透明界限,溶剂的选择： (1) 端吸收 (2) 样品浓度 (3) 溶质和溶剂分子之间的作用力 (4) 溶剂的挥发性、稳定性、精制的再现性等。,生色团 (chromophore)：产生紫外(或可见)吸收的不饱和基团，如CC、CO、NO2等。 助色团 (auxochrome)：其本身是饱和基团(常含杂原子)，它连到生色团时，能使后者吸收波长变长或吸收强度增加

10、(或同时两者兼有)，如：OH、 NH2、Cl等。 深色位移 (bathochromic shift)：由于基团取代或溶剂效应，最大吸收波长变长。深色位移亦称为红移(red shift)。 浅色位移 (hypsochromic shift)：由于基团取代或溶剂效应，最大吸收波长变短。浅色位移亦称为蓝移(blue shift)。 增色效应 (hyperchromic effect)：使吸收强度增加的效应。 减色效应 (hypochromic effect)：使吸收强度减小的效应。,基本术语,基本原理（Basic principle）,各类化合物的紫外吸收,1. 简单分子,A. 饱和的有机化合物 a

11、. 饱和的碳氢化合物 *跃迁，紫外吸收的波长很短。 b. 含杂原子的饱和化合物 杂原子一般为助色团，有n *跃迁。近紫外区仍无明显吸收。 硫醚、二硫化物、硫醇、胺、溴化物、碘化物在近紫外有弱吸收，但其大多数均不明显。 B. 含非共轭烯、炔基团的化合物 都含电子，可以发生*跃迁，其紫外吸收波长较 *为长，但乙烯吸收在165nm、乙炔吸收在173nm。因此，它们虽名为生色团，但若无助色团的作用，在近紫外区仍无吸收。 C. 含不饱和杂原子的化合物 *、 *属远紫外吸收， n *亦属远紫外吸收，不便检测， 但 n *跃迁在紫外区，可检测。吸收强度低，但吸收位置较佳，易于检测。因此，在紫外鉴定中是不应忽

12、视的。,各类化合物的紫外吸收,2. 含有共轭体系的分子,A. 共轭体系的形成使吸收移向长波方向 一般把共轭体系的吸收带称为K带 (源于德文konjugierte)。K带对近紫外吸收是重要的，因其出现在近紫外范围，且摩尔吸收系数也高，一般10000。,B. 共轭醛、酮紫外吸收(K带)的计算,各类化合物的紫外吸收,2. 含有共轭体系的分子,C. a, b不饱和酸、酯,各类化合物的紫外吸收,2. 含有共轭体系的分子,一些共轭羧酸的UV吸收： 化合物 实测值（104） 计算值 CH2=CHCO2H 200（1.0） CH3CH=CHCO2H 205（1.4） Ph=CHCO2H 220（1.4） 22

13、2（2175） CH3 (CH=CH)2CO2H 254（2.5） 256（3018208） CH3 (CH=CH) 3CO2H 294（3.7） 286（6018208） CH3 (CH=CH)4CO2H 332（4.9） 316（9018208）,各类化合物的紫外吸收,3. 芳香族化合物,A. 苯 苯环显示三个吸收带，它们均起源于苯环*的跃迁，如上表所示。 B. 烷基苯 C. 助色团在苯环上取代的衍生物 D. 生色团在苯环上取代的衍生物 NO2CHOCOCH3CO2HCOO-CN E. 多取代苯环 F. 杂芳环化合物,苯 萘 蒽 苯并蒽,各类化合物的紫外吸收,3. 芳香族化合物,A. 苯

14、苯环显示三个吸收带，它们均起源于苯环*的跃迁，如上表所示。 B. 烷基苯 C. 助色团在苯环上取代的衍生物 D. 生色团在苯环上取代的衍生物 NO2CHOCOCH3CO2HCOO-CN E. 多取代苯环 F. 杂芳环化合物,苯 萘 蒽 苯并蒽,各类化合物的紫外吸收,3. 芳香族化合物,A. 苯 苯环显示三个吸收带，它们均起源于苯环*的跃迁，如上表所示。 B. 烷基苯 C. 助色团在苯环上取代的衍生物 D. 生色团在苯环上取代的衍生物 NO2CHOCOCH3CO2HCOO-CN E. 多取代苯环 F. 杂芳环化合物,苯 萘 蒽 苯并蒽,紫外谱图的解析, 化合物在220800nm内无紫外吸收，说明

15、该化合物是脂肪烃、脂环烃或它们的简单衍生物(氯化物、醇、醚、羧酸等)，甚至可能是非共轭的烯。 220250nm内显示强的吸收(近10000或更大)，即存在共轭的两个不饱和键(共轭二烯或a,b 不饱和醛、酮)。 250290nm内显示中等强度吸收，且常显示不同程度的精细结构，说明苯环或某些杂芳环的存在。 250350nm内显示中、低强度的吸收，说明碳基或共轭羰基的存在。 300nm以上的高强度吸收，说明该化合物具有较大的共轭体系。若高强度吸收具有明显的精细结构。说明稠环芳烃、稠环杂芳烃或其衍生物的存在。,提供有关该化合物的共轭体系或某些碳基等的存在的信息。,蓝移、红移、pH值影响,紫外可见分光光

16、度仪,主机由光源（氘灯或钨灯）、单色器（或双色器）、样品室、检测系统、电机驱动、计算机接口、电源等部分组成。,.au/creswick/facilities/analyt_lab.html,Instruments: Cary 300, Cary 50 with fiber optic probe,single beam uv-vis spectrophotometer,紫外可见分光光度仪,dual-beam uv-vis spectrophotometer,紫外可见分光光度仪,光谱扫描 如实地显示样品的全波长图谱，是化学分析

17、工作者的常规分析手段。 参数设置： A、光度范围： B、取样间隔： C、扫描速度： 测量运行： 比色皿(cuvette)校正,定性分析,单波长标准系数法 双波长等吸收点法 双波长系数倍率法 三波长法,定量分析,Beer-Lambert Law,朗伯比尔定律,A=吸光度 I0=入射光强度 I=入射光通过样品后的透射强度 摩尔吸光度（cm-1.m-1） C=摩尔浓度(mol) l=光程(cm),标准曲线法,在决定一系列维生素、抗菌素及一些天然物结构曾起过重要作用，如维生素A1、A2、B12、B1、青霉素、链霉素、土霉素、萤火虫尾部的发光物质（是由荧光酶(luciferase)作为酶催化底物分子荧光

18、素(luciferin)）等。 紫外吸收光谱用来决定双键的位置，既简单又有效，例如：,松香酸 235248nm,左旋海松酸 260283nm,紫外光谱应用举例,For the spectrum on the right, a solution of 0.249 mg of the unsaturated aldehyde in 95% ethanol (1.42 10-5 M) was placed in a 1 cm cuvette for measurement. Using the above formula, = 36,600 for the 395 nm peak, and 14,0

19、00 for the 255 nm peak. Note that the absorption extends into the visible region of the spectrum, so it is not surprising that this compound is orange colored.,Typical UV / VIS spectum of chlorophyll a in dry diethyl ether on a Shimadzu Spectrophotometer UV 3101.,http:/www.ch.ic.ac.uk/local/projects

20、/steer/chloro.htm,Typical UV / VIS spectum of chlorophyll a in dry diethyl ether on a Shimadzu Spectrophotometer UV 3101.,http:/www.ch.ic.ac.uk/local/projects/steer/chloro.htm,UV-vis spectrum of bisulphide in sewage,二硫化物,(下水道里的)污物,p-硝基苯酚降解的UV-Vis光谱图,The n electrons (or the nonbonding electrons) are

21、the ones located on the oxygen of the carbonyl group of tetraphenyclopentadienone. Thus, the n to pi* transition corresponds to the excitation of an electron from one of the unshared pair to the pi* orbital.,/bacher/UV-vis/uv_vis_tetracyclone.html.html,Tetraphenylcyclopentadie

22、none 四苯基环戊二烯酮,/TFrey/Bio750/UV-VisSpectroscopy.html,Protein absorbances come from 3 sources,1. Peptide Bond,Asp, Glu, Asn, Gln, Arg, and His sidechains have absorption in this region also (190 - 230 nm) but is very weak compared to peptide bond p - p*. Absorption in the 190-230

23、 nm region can be and is used to quantitate protein/peptide concentrations, but this is complicated by many compounds used in buffers which also absorb at these wavelengths.,What about Proteins?,What about Proteins?,Phe e250 = 400 symmetry forbidden p - p* Tyr e274 = 1400 p - p* Trp e280 = 4500 at l

24、east 3 different transitions. A280 is one of the most commonly used methods to measure protein concentration (aside from colorimetric methods such as the Lowry or Bradford dye binding assays), but this method is obviously very sensitive to differences in amino acid composition.,2. Aromatic Amino Aci