第一代测序技术.ppt

1、测序技术,卡丽比努尔艾依提 应用微生物,目录,第一代测序技术 第二代测序技术（Illumina测序仪，SOLiD测序仪，454基因组测，Ion Torrent 测序） 第三代测序技术 高通量测序技术,第一代测序技术的发明人,利用DNA聚合酶和双脱氧链终止测定DNA核苷酸序列的方法。是英国剑桥分子生物学实验室的生物化学家Fred Sanger及其同事在1997年发明的。,第一代测序技术,传统的链终止法，化学讲解法，以及在它们的基础上来的各种DNA测序技术传统成为第一代DNA测序技术。,原理,第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。

2、用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3OH基团，所以可被用作链终止试剂）通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。 测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反应分四组（如下图）进行，每一组分别用四种ddNTP（双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止，再用PAGE分析四组样品。从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。,这有四组试剂，第一组含有A,T,C三种脱氧核苷酸，G这一种双脱氧核苷酸,测序是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、

3、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。 Sanger法测序的原理就是，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之扩增，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)使之终止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。,每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几个至千以上个，相差一个碱基一系列片断。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可

4、用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。,应用,具有代表性的新一代DNA测序仪,大规模平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform）的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据 最近市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa technol

5、ogy公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪、Dover/Harvard公司的Polonator测序仪以及美国Helicos公司的HeliScope单分子测序仪。 所有这些新型测序仪都使用了一种新的测序策略循环芯片测序法（cyclic-array sequencing），也可将其称为“新一代测序技术或者第二代测序技术”。,循环芯片测序法,所谓的循环芯片测序法，简言之就是对布满DNA样品的芯片重复进行基于DNA的聚合酶反应（模板变性、引物退火杂交及延伸）以及荧光序列读取反应。 与传统测序法相比，循环芯片测序法具有操作更简易、费用更低廉

6、的优势，于是很快就获得了广泛的应用。,虽然这些新一代测序仪以及芯片的实际制作过程似乎都和传统的测序方法有很大的不同，而且各有特点，但实际上它们背后的原理和技术都是非常相似甚至是相同的（图1b）。新一代测序法首先也是将基因组DNA随机切割成小片段DNA分子，然后在体外给这些小片段分子的末端连接上接头制成文库，也可以使用配对标签（mate-paired tag）制成跨步文库（jumping libraries）。随后可以通过原位polony（in situ polony，小词典1）、微乳液PCR（emulsion PCR）或桥式PCR（bridge PCR）（图5）等方法获得测序模板。,上述方法有

7、一个共同点，那就是任何一个小片段DNA分子的PCR扩增产物都是在空间上聚集的：原位polony法和桥式PCR法中所有的产物都集中在平板的某处，在微乳液PCR法（emulsion PCR）中所有的产物都集中在微珠的表面。真正的测序反应本身和传统测序法一样，是由重复的聚合酶促反应和最后的荧光读取分析反应组成（图6）。本文讨论的所有测序仪都是使用合成测序法（sequencing by synthesis），即通过聚合酶或连接酶不断地延伸引物获得模板序列，最后对每一轮反应的结果进行荧光图像采集、分析，获得序列结果。,以Illumina测序仪说明二代测序的一般流程,（1）文库制备，将DNA用雾化或超声波

8、随机片段化成几百碱基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，紧接着磷酸化并增加一个核苷酸黏性末端。然后将Illumina测序接头与片段连接。 （2）簇的创建，将模板分子加入芯片用于产生克隆簇和测序循环。芯片有8个纵向泳道的硅基片。每个泳道内芯片表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。通过不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。 （3）测序，分三步：DNA聚合酶结合荧光可逆终止子，荧光标记簇成像，在下一个循环开始前将结合的核苷酸剪切并分解。 （4）数据分析.,Ion Torr

9、ent测序,Ion Torrent个人化操作基因组测序仪（PGMTM）是第一台基于半导体技术的测序仪。与其他测序技术相比，使用该项技术的测序系统更简单、更快速、及更易升级。该测序仪与其他高通量测序仪特征互补，可以迅速完成应急服务项目，缩短服务周期，增加服务效率。 主要应用领域：扩增子测序，RNA单链测序，基因组及宏基因组测序,测序,Ion Torrent 测序原理,鸟枪法建库 基于油包水PCR的微珠模板扩增 微珠加上测序引物和聚合酶后，被加裁到有PH微传感器的测序芯片 在测序芯片表面，分次分别流过种dNTP，微珠表面的核酸进行边合成边测序的反应。每次发生聚合反应，释放出H+离子，微珠周围微环境

10、中的PH值发生改变。 微电极检测PH值的改变，转换成相应的碱基信号，最后得到DNA序列,Roche 454 的测序原理,鸟枪法建库 基于油包水PCR的微珠模板扩增 微珠加上测序引物和聚合酶后，被加裁到有PH微传感器的测序芯片 在测序芯片表面，分次分别流过种dNTP，微珠表面的核酸进行边合成边测序的反应。每次发生聚合反应，释放出焦磷酸 焦磷酸被焦磷酸酶水解，释放出光子 光通过光纤被传递到光探头 光信号被转换成碱基信息，得到DNA序列。,SOLiD测序,SOLiD使用连接法测序获得基于“双碱基编码原理”的SOLiD颜色编码序列，随后的数据分析比较原始颜色序列与转换成颜色编码的reference序列

11、，把SOLiD颜色序列定位到reference上，同时校正测序错误，并可结合原始颜色序列的质量信息发现潜在SNP位点。,SoLID测序原理,鸟枪法建库 油包水PCR，得到长了DNA片段的珠子 珠子放到测序芯片上 加入4种荧光色的寡聚物探针进行杂交，探针上有2个位置的碱基是特定的，别的位置是简并的碱基 加入连接本酶，把能够杂上的寡聚物连到测序引物上 洗掉过量的探针,激光扫描看荧光 重复47步骤，得到延长3650个碱基的长度 洗掉第一次的测序延长链 错位加入荧光探针，重复48的过程 把错位的荧光信号排列组合，得到DNA序列,应用,高通量测序,高通量测序技术（High-throughput sequ

12、encing）又称“下一代”测序技术（Next-generation sequencing technology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。 根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等，主要有以下几种：大规模平行签名测序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆（Polony Sequencing）、454焦磷酸测序（454 pyrosequencing）、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序（Ion

13、semiconductor sequencing）、DNA 纳米球测序 （DNA nanoball sequencing）等。,高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deepsequencing)。,实验过程,1.样本准备（sample fragmentation） 2.文库构建(library preparation) 3.测序反应(se

14、quencing reaction) 4.数据分析(data analysis),技术应用,测序技术推进科学研究的发展。随着第二代测序技术的迅猛发展，科学界也开始越来越多地应用第二代测序技术来解决生物学问题。 这边需要特别指出的是第二代测序结合微阵列技术而衍生出来的应用-目标序列捕获测序技术（Targeted Resequencing）。 目前，高通量测序开始广泛应用于寻找疾病的候选基因上。 以上我们盘点了2010年第二代测序技术的最新进展和相关应用。但是除了第二代测序之外，还有另外一种以单分子实时测序和纳米孔为标志的第三代测序技术也正在如火如荼的发展中，只是还没有正式发布。所以目前科学界所说

15、的高通量测序还指的是第二代测序。,意义,高通量测序技术的诞生可以说是基因组学研究领域一个具有里程碑意义的事件。该技术使得核酸测序的单碱基成本与第一代测序技术相比急剧下降, 以人类基因组测序为例, 上世纪末进行的人类基因组计划花费 30 亿美元解码了人类生命密码, 而第二代测序使得人类基因组测序已进入万(美)元基因组时代。如此低廉的单碱基测序成本使得我们可以实施更多物种的基因组计划从而解密更多生物物种的基因组遗传密码。同时在已完成基因组序列测定的物种中, 对该物种的其他品种进行大规模地全基因组重测序也成为了可能。,第三代测序技术,第三代测序技术是指单分子测序技术。DNA测序时，不需要经过PCR扩

16、增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。,原理,第三代测序技术原理主要分为两大技术阵营： 第一大阵营是单分子荧光测序，代表性的技术为美国螺旋生物(Helicos)的SMS技术和美国太平洋生物(Pacific Bioscience)的SMART技术。脱氧核苷酸用荧光标记，显微镜可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。 第二大阵营为纳米孔测序，

17、代表性的公司为英国牛津纳米孔公司。新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔 来实现测序的。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，而ATCG单个碱基的带电性质不一样，通过电信号的差异就能检测出通过的碱基类别，从而实现测序。,第三代测序技术解决关键技术,第一：因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候，DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景。这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。Pacific Biosciences公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔zero-mode wave

18、guides (ZMWs)，单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。在这么小的孔内，DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了非常稳定的背景荧光信号。而当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学键形成，荧光基团被DNA聚合酶切除为止。 第二：共聚焦显微镜实时地快速地对集成在板上的无数的纳米小孔同时进行记录。,第三代测序技术特点,它实现了DNA聚合酶内在自身的反应速度，一秒可以测10个碱基，测序速度是化学法测序的2万倍. 它实现了DNA聚合酶内在自身的延续

19、性，一个反应就可以测非常长的序列。二代测序现在可以测到上百个碱基，但是三代测序现在就可以测几千个碱基。 它的精度非常高，达到99.9999%。 直接测RNA的序列。既然DNA聚合酶能够实时观测，那么以RNA为模板复制DNA的逆转录酶也同样可以。RNA的直接测序，将大大降低体外逆转录产生的系统误差。 第二个是直接测甲基化的DNA序列。实际上DNA聚合酶复制A、T、C、G的速度是不一样的。正常的C或者甲基化的C为模板，DNA聚合酶停顿的时间不同。根据这个不同的时间，可以判断模板的C是否甲基化。,第三代测序技术的应用,基因组测序：由于具有读长长的特点，SMRT测序平台在基因组测序中能降低测序后的Contig数量，明显减少后续的基因组拼接和注释的工作量，节