流式细胞术系列之-白血病免疫分型.ppt

1、流式细胞术在白血病免疫分型中的应用,白血病细胞起源、分化和生物学行为不同，构成了白血病的异质性，因此急性白血病的全面、正确分型是准确、及时治疗的前提。急性白血病的分型基本上分三个阶段：,FAB分型(1976) (morphology，M ),MIC分型（1986） (morphology，M ) (immunology， I ) ( cytogenetics，C ),WHO分型(2001) （MICM） (morphology，M ) (immunology， I ) ( cytogenetics，C) (molecular biology, M),急性白血病分型历史,急淋 （ALL）,急性白

2、细胞FAB分型,急非淋 （ANLL） 急性髓细胞白血病(AML),L1型,L2型,L3型,M0: 微分化型髓系白血病； M1：未分化的原粒细胞白血病； M2：部分分化的原粒细胞白血病； M3：急性早幼粒细胞白血病； M4：急性粒、单核细胞白血病； M5：急性单核细胞白血病； M6：急性红血病或红白血病； M7：急性巨核细胞白血病。,MIC分型以形态学为基础、免疫学和细胞遗传学作补充，相互结合，使分型更趋精确。其中免疫学分型是另外两种方法的重要补充。,MIC分型,形态学 (morphology， M ) ：传统的骨髓片检查 免疫学 (immunology， I ) ：免疫组化 流式细胞术 细胞遗

3、传学 ( cytogenetics，C ) ：染色体分型,流式细胞术白血病免疫分型优点,流式细胞仪可方便、快速、准确地完成白血病的免疫学分型，其意义在于： 准确寻找和计数幼稚或异常的细胞群体； 用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病； 形态学为急性淋巴细胞白血病（ALL），但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记； 混合性白血病； 帮助确定髓系白血病所属类型； 慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤； 微小残留白血病。,利用荧光素标记的单克隆抗体鉴定细胞表面或细胞内的免疫标志，可准确反映白血病细胞的所属系列（TB髓）及分化程度。 检测分析时，首先根据CD45表达强弱和细胞颗粒度，在CD45-SSC图中确定

4、幼稚或异常的细胞群体。然后分析检测各种标志的表达情况及其阳性率。,白血病免疫分型原理,CD4、CD8、CD61、CD56、CD38,本实验室现有的白血病免疫分型抗体组合,CD3CD79aMPO,可以确定白血病分别属于T/B/髓系,表面染色,胞内染色,全套,进一步细分,其它,必要时可以加用,泛白细胞标志：CD45,标本来源,（1）外周血 （2）骨髓穿刺液， （3）骨髓活检标本 （4）淋巴组织穿刺,样本保存,要 求： 室温条件(16 -28 )存放； 如非液态标本，则要在标本中加入足量的等渗液体（如 生理盐水或组织培养液）。,保存时间,肝素抗凝的外周血和骨髓标本，存放时限为4872小时； EDTA

5、抗凝标本，存放时限只有12 24小时，因为髓细胞在此条件下会裂解； 柠檬酸（ACD）抗凝的外周血标本可存放72小时以上。但此方法不推荐用于骨髓穿刺标本，因为高浓度的ACD会引起pH值变化而导致骨髓细胞死亡,正常骨髓流式分析图,CD45/SSC 图中可见： CD45 强阳性SSC 低信号的细胞群为淋巴细胞(褐色细胞群体) 中等强度的CD45 表达SSC 信号最强的细胞群体为粒细胞(蓝色及红色细胞群体) CD45 表达与SSC 信号介于淋巴细胞与粒细胞之间的是单核细胞群体(绿色细胞群体) CD45 阴性SSC 信号最低的有核红细胞和细胞碎片,根据骨髓细胞CD45/SSC 图中分布情况设门圈定各类细

6、胞 R1 门为成熟淋巴细胞 R2 门为正常单核细胞位置 R3 门正常粒细胞位置 R4 门为幼稚淋巴细胞出现位置 R5 门为有核红细胞或细胞碎片位置 R6 门为幼稚髓细胞出现位置 白血病细胞通常会在R4 R6 两门位置处出现,T-ALL,在CD45/SSC点图中，幼稚细胞群体低SSC信号，与成熟淋巴细胞比较CD45弱表达,白血病流式免疫分型举例,CD5、CD7、cCD3、CD34阳性,B-ALL,在CD45/SS点图中，幼稚细胞群体低SSC信号，与成熟淋巴细胞比较CD45弱表达,CD19、CD20、CD10、cCD72、CD34、HLA-DR阳性,AML-M0,幼稚细胞群体的FSC和SSC信号低

7、，在CD45/SSC点图中特征性地与幼稚淋巴细胞区域相连，Blasts 90%。,CD13和/或CD33阳性， CD34、HLA-DR通常阳性，缺乏髓系成熟分化抗原：CD11B，CD15等，有时会表达CD7或CD4；MPO阳性率一般小于3%。,AML-M1,幼稚细胞群体的FSC和SSC信号与M0相似，Blasts 90%。,CD13和/或CD33阳性 HLA-DR阳性 CD34阳性 CD11B，CD15等(+/-) 3%的幼稚细胞表达MPO。,此类型白血病细胞除了占优势的幼稚细胞外还存在已明显分化的细胞群体，至少已分化至早幼粒细胞或粒细胞水平。 其典型的形态学特征表现在SSC vs CD45图

8、中可观察到一群比较分散的细胞群，此群细胞与成熟粒细胞相互交叉。,AML-M2（急性粒细胞白血病部分成熟型）,CD45/SSC图中细胞分布广泛与M1不同，这是因为M2细胞已进一步分化幼稚细胞减少，粒细胞增多并与BLAST WINDOWS区域内细胞相连。,CD13和/或CD33阳性，HLA-DR阳性，CD15与D11B (+/-) 。CD34阳性/阴性，MPO阳性。,AML-M3 （急性早幼粒细胞白血病）,左图为M3V，少颗粒（细颗粒）型早幼粒白血病细胞，细胞中颗粒少SSC信号低而集中。 通过CD45/SSC双参图可辨别出M3与M3V。右为经典M3多颗粒细胞的CD45/SSC图。,CD13和/或C

9、D33阳性，CD15阳性，CD34、HLA-DR、CD14阴性，偶尔表达CD2。MPO阳性。,典型M4CD45/SSC图中会出现一群异常的单核细胞和一群骨髓幼稚细胞。 有时这两群细胞会相互叠加占据BLAST WINDOWS和成熟单核细胞位置，故难圈出独立成群的肿瘤细胞。 对于M4病例一般都设多个门对异常细胞进行分析，且每个异常细胞群根据其成熟度的不同，表型也可能互不相同。 本例为M4EO，增多的嗜酸细胞SSC信号与早幼粒相似;CD45信号与单核细胞相似。,AML-M4 （急性粒单细胞白血病）,CD13和/或CD33阳性，CD33CD13，HLA-DR、CD14（+/-）、CD15与CD11B阳

10、性。CD34阳性/阴性，MPO阳性。,在M5病例中除部分白血病细胞向单核细胞分化外，剩余的白血病细胞都是幼稚细胞，且这些幼稚细胞在CD45 vs RALS 图中占据blast windows，CD34阳性但单核细胞系相关抗原为阴性。 表型与M4相似，CD13和/或CD33阳性，CD33CD13，HLA-DR、CD14（+/-）、CD15与CD11B阳性。CD34阳性/阴性，MPO阳性。,AML-M5 （急性单核细胞白血病）,M5肿瘤细胞从细胞大小、颗粒度和CD45表达都向成熟单核细胞过渡，形成一大细胞群体。,CD33CD13，HLA-DR、CD14（+/-）、CD15与CD11B阳性。CD34

11、阳性/阴性，MPO阳性。,髓细胞白血病红细胞分化型对应于FAB的M6，在形态学上幼稚红细胞计数大于髓系细胞的50%且髓系幼稚细胞占非红细胞的30%以上。然而因为幼红会因标本处理中溶血步骤而被破坏，当流式细胞仪分析时有核红细胞占总细胞数的50%以下时，红细胞白血病很难与MDS（骨髓增生异常综合症）和早期白血病区分开来。,AML-M6 （急性红白血病）,CD13、CD33、CD34、HLA-DR、CD15与CD11B可以阳性，血型糖白A阳性，MPO阳性/阴性。,本例中可见两群幼稚细胞，M6的定义是红系祖细胞占骨髓幼稚细胞群体的50%强，而其他系别的幼稚细胞可占30%以上。 固诊断M6时要依据形态学红系细胞的数量来确定，如仅根据免疫分型很难得出正确诊断，必须结合形态计数幼稚细胞数量来确定。以上是典型的M6免疫分型图，出现两群幼稚细胞。,诊断巨核细胞白血病通常依靠免疫分型，因为形态学和遗传学都不能对此做出明确诊断且从超微结构上判别血小板过氧化物酶存在技术上的难点。 巨核细胞白血病细胞高表达CD61和CD41。,AML-M7 （急性巨核细胞白血病）,M7,CD13、CD33、 CD34、HLA-DR可以阳性，CD41、CD6